题目：原子力显微镜研究磁场药物作用后细胞DNA的变化

目的：用原子力显微镜研究稳恒磁场及稳恒磁场联合抗肿瘤药物对肿瘤细胞DNA形貌的影响，以初步了解磁场与抗肿瘤药物对肿瘤细胞协同杀伤的可能机制。
方法：
1．使用不同浓度的多聚赖氨酸对云母表面进行直接滴加和镀膜两种方式进行处理修饰，AFM观察这些修饰方式与多聚赖氨酸浓度对云母表面形貌的影响，以选择合适的修饰条件。
2．使用不同浓度的多聚赖氨酸对云母表面镀膜修饰，AFM观察细胞DNA在云母表面的沉积和展层；AFM观察多聚赖氨酸不同处理方式下修饰时DNA分子在云母表面的吸附与沉积效果。

3．用原子力显微镜观察不同DNA提取试剂盒提取DNA的效果，选取适于AFM实验的DNA提取试剂盒。
4．原子力显微镜对曝磁不同时间后的K562细胞DNA进行形貌变化的观察。
5. 使用原子力显微镜对磁场及磁场联合不同抗肿瘤药物作用后的K562细胞DNA进行形貌的观察和分析，了解磁场与抗肿瘤药物对肿瘤细胞的协同杀伤效应与细胞DNA的关系。
结果：
1．多聚赖氨酸直接滴加至云母基底上，其表面形成大小不同的颗粒与聚集体。用镀膜方式后，云母表面颗粒数量减少，颗粒粒度明显变小。相同多聚赖氨酸的浓度修饰云母，镀膜法使云母基底的表面平均粗糙度（Ra）更小。随多聚赖氨酸浓度降低，云母表面粗糙度随之减小，多聚赖氨酸浓度降至0.1µg/ml及以下时云母表面的粗糙度不再有明显变化。
2．云母表面经1µg/ml多聚赖氨酸镀膜修饰后，吸附于云母表面的DNA数量最多，多数DNA发生缠绕、聚集且背景中残留有大颗粒杂质。随多聚赖氨酸使用浓度的降低，云母表面的DNA吸附量逐渐减少，0.5µg/ml多聚赖氨酸镀膜处理时，云母表面逐渐有线性DNA出现且干扰性杂质明显下降。多聚赖氨酸降至0.1µg/ml时，DNA铺展良好，全部以线性单分子的形式沉积于云母表面，直线形态的DNA占总DNA的比重最高，且背景中未出现明显的干扰杂质。进一步降低多聚赖氨酸时，DNA链逐渐发生弯曲和聚集，多聚赖氨酸为0.01µg/ml时，云母表面仍具备对DNA的吸附能力，但DNA链已开始发生弯曲且部分DNA出现交联。未修饰的裸云母表面，DNA可出现交联或聚集缠绕。直接滴加多聚赖氨酸修饰云母基底时，DNA链的伸展性较差，DNA发生交联且聚集成网状结构。多聚赖氨酸镀膜修饰的云母表面DNA链的分散度较好，可舒展成单根直线状形态。
3．原子力显微镜观察结果显示，天根试剂公司生产试剂盒提取的DNA长度较长，DNA表面较为平滑，背景干扰少；艾德莱试剂公司的DNA提取试剂盒获取的细胞DNA较短，且表面较为粗糙，DNA的高度较高，背景的干扰性颗粒杂质相对较多。
4．K562细胞曝磁12h后，细胞DNA节点数量增加，有交联出现。曝磁24h后， DNA碎片明显增加，DNA长度变短，部分DNA链发生断裂。细胞经磁场作用36h后，DNA链几乎全部断裂，DNA碎片相互交联成大小不等的片状聚合体。
5（1）磁场及磁场与阿霉素联合处理K562细胞12h后，磁场处理组细胞DNA形态变化明显，DNA节点增加，DNA发生交联或缠绕聚集。阿霉素(25ng/ml)作用后的细胞，其部分DNA链弯曲，少量DNA出现交联。磁场和阿霉素联合作用12h后，细胞DNA形态显著改变，DNA长度明显变短，大量DNA交联、缠绕聚集形成板状聚集体。
（2）细胞曝磁24h后，小片段DNA明显增多，DNA长度变短，部分DNA链断裂。紫杉醇（10ng/ml）作用24h后，DNA链发生弯曲，节点数量增加，少量DNA交联，且DNA表面较为粗糙。磁场和紫杉醇共同作用细胞24h后，多数DNA分子交联成板状聚集体，少量DNA链弯曲，DNA损伤明显加剧。
（3）原子力显微镜观察结果显示，曝磁12h，多数细胞DNA链出现长短不一的分支，DNA链的长度变短，节点数量增加，DNA出现交联和增粗。细胞经0.4mg/ml的环磷酰胺作用12h后，多数DNA链交联成网状，部分DNA相互扭结缠绕。细胞经磁场和环磷酰胺联合作用12h后，DNA长度明显变短，节点增加，部分DNA交联成板状聚集结构和多分支结构。
结论：
1．相对直接滴加多聚赖氨酸，镀膜修饰时多聚赖氨酸在云母表面分布的更均匀，云母表面的粗糙度更小、表面平整性更高。经0.1μg/mL及以下浓度的多聚赖氨酸镀膜修饰后，云母表面的粗糙度无明显变化，云母表面极为平坦。
2．云母表面经0.1μg/mL多聚赖氨酸镀膜修饰后，DNA分子的伸展效果更好；相对直接滴加多聚赖氨酸和未经任何处理的裸云母，镀膜修饰后的云母表面更适于细胞DNA的吸附和展层。
3．相对艾德莱公司的DNA提取试剂盒，天根公司试剂盒提取的细胞DNA质量较高，能较好地满足AFM实验的需求。
4．细胞经磁场处理后，随曝磁时间的延长细胞DNA经历了交联-断裂-断裂与交联并存的变化过程，磁场对细胞DNA的损伤具有时间累积效应，随曝磁时间的延长DNA损伤加剧。
5．细胞经磁场处理后DNA有断裂和交联发生，药物处理后细胞DNA易于弯曲和交联，且DNA分子相对高度明显增加。磁场和药物联合作用后，DNA可交联成板状聚集体，与药物处理或曝磁细胞相比，DNA的损伤明显加剧。
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关键词：多聚赖氨酸，镀膜，原子力显微镜，DNA，磁场，抗肿瘤药物，协同杀伤