题目：黄脸油葫芦雌激素相关受体(ERR)和蜕皮激素受体(EcR)的克隆及其在发育过程中的表达研究

黄脸油葫芦（Teleogryllus emma (Gryllusmitratus Burmeister)）隶属于直翅目（Orthoptera），蟋蟀科（Gryllidae），是一种重要的资源昆虫，可用于饲料、医疗和食品领域，具有特殊的经济价值，并且由于其个体大、易于解剖，因而是研究昆虫发育及基因表达调控的良好实验材料。
核受体(nuclear receptor，NR)是一类可以扩散并能与特异性配体结合的细胞内信号蛋白，它们是配体依赖性的转录因子，与配体结合后可以在细胞核内调节基因表达从而使配体发挥作用。在核受体中有一类核受体没有发现其天然的配体，其独自作用即能行使生物学功能，我们称之为孤儿核受体。雌激素相关受体（estrogen receptor-related receptor, ERR）是人类发现的最早的孤儿核受体之一，在结构上它与雌激素受体（estrogen receptor，ER）非常相似，对哺乳类动物的研究表明，ERRs参与ER信号通路，与众多生长发育过程密切相关，并且参与细胞的增殖与分化，但是却不能与雌激素相结合。在昆虫中也发现ERR的存在，但是其具体作用仍然不是很清楚。蜕皮激素受体（ecdysteroid receptor，EcR）是昆虫中唯一一个配体已知的核受体，它的配体为蜕皮激素（ecdysteroid hormones, EH）。昆虫生长发育过程中，蜕皮和变态等生理过程都受到蜕皮激素的严格调控，EcR是蜕皮激素的作用靶标，处于昆虫变态、蜕皮及繁殖等生命过程级联反应的启动位置，对于完成昆虫生长发育及繁殖过程具有十分重要的作用。
本文以黄脸油葫芦为实验材料，通过RT-PCR技术、RACE末端扩增技术、荧光实时定量RT-PCR技术以及原位杂交技术对黄脸油葫芦雌激素相关受体（estrogen receptor relative receptor，ERR）基因及蜕皮激素受体（ecdysone receptor，EcR）进行克隆和发育的定位定量表达分析， 研究结果如下：
1. 黄脸油葫芦ERR基因 cDNA序列全长1618 bp，包含一个长度为1206 bp的开放阅读框（open reading frame, ORF），编码401个氨基酸残基。5’端非编码区（5’-UTR）长度为140 bp，3’-UTR为272 bp。编码的蛋白质分子量为45.6 kDa，理论等电点pI=8.94。同源性分析表明该蛋白与金小蜂、意大利蜜蜂、拟黑多刺蚁、埃及伊蚊等相似率都高达84%左右，甚至与两栖爬行类、哺乳类包括人类在蛋白质序列上都有很高的相似性。生物信息学分析表明，ERR蛋白属于非分泌性蛋白，一级氨基酸序列所包含的许多功能基序信息以及CD（conserve domain）保守区预测的功能区与其他ERRs蛋白序列都是高度保守的。因此，可以确定本次克隆所获得序列为黄脸油葫芦ERR基因的全长cDNA序列，命名为TeERR并上传GenBank，获得序列号为FJ770332。
2．黄脸油葫芦EcR基因cDNA序列全长2558 bp，包含一个长度为1596 bp的开放阅读框，编码531个氨基酸残基。5’-UTR为555 bp，3’-UTR为407 bp。编码的蛋白质分子量为59.7 kDa，理论等电点pI=8.57。该蛋白质序列与数据库中其他物种的EcR蛋白质序列同源性非常高，黄脸油葫芦TeEcR与直翅目昆虫亚洲飞蝗（Locusta migratoria）相似率最高达92%，与德国小蠊（Blattella germanica）,赤拟古盗（Tribolium castaneum）, 体虱（Pediculus corporis） 相似率也在87%-89%之间。生物信息学分析表明，EcR蛋白属于非分泌型、非糖基化蛋白，含有多个在进化上高度保守的功能位点。将黄脸油葫芦EcR基因命名为TeEcR，并上传GenBank，获得序列号为HQ131915。
3. 采用荧光实时定量RT-PCR方法对黄脸油葫芦雌雄个体不同发育阶段的整体及性腺的TeERR mRNA表达水平进行相对定量分析。结果表明，TeERR基因在所检测的各个样本内均有表达，从整个发育阶段TeERR mRNA水平表达量来看，TeERR在黄脸油葫芦胚胎阶段表达量较高，但随着幼虫的发育，TeERR 的表达量显著降低，在四龄若虫阶段达到最低，随后在成虫阶段又有一些升高。在胚胎期的高表达量显示出其在胚胎发生和细胞增殖与分化过程中的重要作用。在不同发育阶段的性腺中，TeERR均有表达的，成虫精巢中TeERR的表达量最高，六龄若虫卵巢中的表达相对较低，但生物统计学分析显示差异不显著。非常有趣的是，在每一个发育阶段中，精巢的TeERR mRNA表达量都是高于卵巢的，由此提示ERR在蟋蟀生殖系统存在某些特别的作用需要我们进一步去阐明。
4．采用荧光实时定量RT-PCR方法对黄脸油葫芦雌雄个体不同发育阶段整体及性腺的TeEcR mRNA表达水平进行相对定量分析。结果表明，TeEcR基因在所检测的各个样本内均有表达，从整个发育阶段TeEcR mRNA水平表达量来看，在胚胎阶段表达量较高，在若虫前期阶段即1-3龄，表达量有所降低，在若虫后期，即4-6龄，表达量又有所回升，在成虫阶段表达量再次降低。EcR的表达水平与蜕皮激素的滴度是密切相关的，但是与其丰度值又不完全一致。这显示出EcR基因的表达并不完全是由蜕皮激素调控的，也可能受到其他基因的调控，例如我们前面提到的孤儿核受体ERR基因，当然这还需要进一步研究才能做出判断。
5. 采用原位杂交方法对黄脸油葫芦雌雄成体脑部及性腺TeERR基因的mRNA表达水平进行定位研究，结果发现TeERR mRNA在蟋蟀脑部广泛表达。除了蕈形体萼部和领部阳性反应比较弱外，其他部位均有阳性神经元胞体和神经纤维存在，并呈现不同的表达模式。根据表达区域的强阳性反应，推测TeERR可能参与视觉和嗅觉信息的获取与整合。在性腺中的研究发现，TeERR mRNA 在卵子发生过程中滤泡细胞的胞质和生长期、卵黄发生期的卵母细胞有表达；在变型期的精细胞质和成熟精子头部表达强烈。在卵子发生早期阶段，滤泡细胞中的TeERR mRNA的阳性表达可能与其自身的增殖和分化有关。卵母细胞生长阶段，卵母细胞和滤泡细胞中的TeERR mRNA表达模式可能说明滤泡细胞给卵母细胞提供了一定的发育信息，而卵黄生成期卵母细胞中TeERR mRNA的表达说明，TeERR mRNA与卵黄物质的形成相关。精子细胞在变形期胞质和成熟精子头部有很强TeERR mRNA，说明TeERR mRNA参与了精子细胞发育调控和精子的成熟过程。
6．采用原位杂交方法对黄脸油葫芦雌雄成体脑部及性腺TeEcR基因的mRNA表达水平进行定位研究，结果发现TeEcR mRNA在蟋蟀脑部广泛表达。无论是雌性还是雄性，蕈形体、视叶、中脑、食道下神经节和球状细胞中都有表达。与雄性相比，雌性脑中，蕈形体和球状细胞中TeEcR mRNA的阳性表达最为明显，食道下神经节、视叶次之，中脑和中央体的表达最弱。而在雄性脑中，蕈形体、视叶、以及球状细胞的阳性反应强度与雌性类似，但在中脑的表达程度更高于雌性，且视叶中表达也更为强烈，这可能与雄性在求偶过程中的主体地位密切相关，TeEcR mRNA在视叶与蕈形体的表达与视觉信息整合相关，进而能够对求偶行为具有调控作用。在性腺中的研究发现，TeEcR mRNA 的表达与TeERR mRNA的表达异常相似，也是在卵子发生过程中滤泡细胞的生长期、卵母细胞的卵黄发生期有表达；在变型期的精子细胞质和成熟精子头部表达强烈，这说明EcR与ERR在调节蟋蟀生殖系统发育的过程中，具有密切的联系。
本项研究首次从直翅目昆虫黄脸油葫芦中克隆获得ERR和EcR基因的全长cDNA序列，并将序列上传GenBank；实时定量及原位杂交方法分析发现，TeERR和TeEcR mRNA在黄脸油葫芦雌雄个体不同发育阶段及成虫脑部和性腺均有表达，这说明这两种基因与昆虫的发育、神经与生殖有关。这些结果将帮助我们进一步探讨核受体在昆虫体内的具体功能，以及为搞清昆虫中类固醇激素在其发育及生理方面关系奠定理论基础。