题目：赤拟谷盗磷化氢抗性品系微卫星多态性缺失及其位点的序列分析

摘  要

赤拟谷盗Tribolium castaneum (Herbst) 是世界范围内广泛分布且具有重要经济意义的害虫，主要危害谷物及储藏物。其危害方式为直接取食、加速谷物霉变、粪便污染等。磷化氢 （PH3）是目前公认的防治储藏物害虫性能最优良的熏蒸剂之一。长期以来，不科学的施用方法，导致了许多地方的多种储粮害虫普遍地对其产生了抗性。由于磷化氢具有不可比拟优越性，它必将在未来的储粮害虫综合治理(IPM)中，仍将扮演极为重要的角色。近年来，赤拟谷盗的发生范围越来越广、危害越来越严重，其抗性问题日益受到重视。从害虫自身出发，阐明基因功能，有助于害虫防治新理论和新技术的研究。微卫星DNA是广泛分布于原核、真核生物基因组中的短小串联重复的DNA序列。多态性缺失是微卫星不稳定性的表现形式。本研究实验材料为四川和河南的抗性品系和敏感品系的120只赤拟谷盗成虫，利用苯酚氯仿法提取基因组DNA，对具有多态性的微卫星标记位点DT802192、EB754173、DN648427、CB337218和DN647734，进行DNA扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，并对出现多态性缺失的DT802192微卫星位点进行切胶回收、纯化、扩增、测序、序列分析，旨在找到与磷化氢抗性相关的基因。研究结果表明，所选用的五个微卫星位点中DT802192出现的多态性缺失频率最高为100%（30/30），EB754173多态性缺失频率为6.67%（2/30），DN648427多态性缺失频率为3.33%（1/30），CB337218和DN647734的多态性缺失频率为0%（0/30），也就是说这两个位点没有出现多态性缺失。对位点DT802192进行多态性缺失与磷化氢抗性相关性分析，经X2检验，P﹤0.01，说明该位点多态性缺失与抗性品系存在着相关性，具有统计学意义。利用生物信息学方法分析DT802192，该序列定位于赤拟谷盗3号染色体上，通过赤拟谷盗cDNA文库EST序列的BLAST，该序列与登录号为LOC655048的序列具有一致性，是赤拟谷盗类似P53基因3＇下游非编码区的一段序列。
本研究的结论有以下几点：
1.对赤拟谷盗敏感品系和抗性品系的研究中发现，微卫星标记位点EB754173、DN648427、CB337218和DN647734中，敏感品系和抗性品系中都具有多态性，但是在微卫星标记位点DT802192的敏感品系中有多态性，抗性品系出现多态性缺失，表明了具有磷化氢抗性的DT802192位点可能存在与抗磷化氢相关的基因，为磷化氢抗性基因的筛选提供了一个很好的途径。
2.选择具有多态性的微卫星标记位点，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳对赤拟谷盗敏感品系和抗性品系进行多态性缺失分析，根据在DT802192位点敏感品系和抗性品系结果不同，可以在分子水平上判断敏感品系和抗性品系，为赤拟谷盗磷化氢抗性品系和敏感品系检测提供了一个新的方法，并且该检测位点的多态性缺失可作为磷化氢抗性程度的重要参考指标。
3.赤拟谷盗cDNA文库的ESTs序列的生物信息学分析结果显示，DT802192序列位于赤拟谷盗3号染色体，与赤拟谷盗类似P53基因的3＇非编码区有较高的一致性，此段非表达序列可能参与到P53基因表达调控中，导致赤拟谷盗对磷化氢产生了抗性，为进一步研究赤拟谷盗磷化氢抗性机制的发生提供有效地分子遗传学指标。
4.PCR多部位、多位点的微卫星标记技术可以快速、有效的检出基因内部的微小缺失和基因组的不稳定性，微卫星不稳定检测可以判断这种现象的存在，可为赤拟谷盗基因组的研究提供了一个有价值的方法。
 
关键词：赤拟谷盗，微卫星不稳定性，多态性缺失，P53基因