题目：大熊猫精液的采集与冷冻保存研究

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）自然繁殖能力低，新鲜精液人工授精率只有33%左右，冷冻精液人工授精率则更低，导致其种群数量持续下降，无法走出濒临灭绝的困境。作为目前应用最广泛并最有成效的辅助生殖技术，冷冻精液人工授精已成为家畜品种改良的重要手段，对挽救大熊猫等珍稀野生动物同样具有十分重要的意义，但因其遗传资源稀缺，冷冻精液人工授精的研究应用相对落后。
精液冷冻保存是人工授精的重要内容，冷冻精子质量的好坏直接影响人工授精受胎率。研究影响冷冻精子质量的因素，发现精子在冷冻-解冻过程中遭受的氧化损伤是一个重要方面，活性氧攻击精子，造成精子结构和功能的完整性遭到破坏，最终导致冷冻精液品质下降。精液冷冻保存过程中添加抗氧化剂在牛、羊、猪等家畜中已有一些研究，并取得一定成果，而将其应用到大熊猫等珍稀野生动物上却鲜有报道。本试验采集大熊猫的精液，经冷冻、解冻过程后检测精子活力、活率、质膜完整率和顶体完整率，筛选大熊猫精液最佳的冷冻保存方法和最适合的解冻液；在此基础上在大熊猫精液解冻液中分别添加维生素类和酶类抗氧化剂，通过检测精子质量指标和丙二醛（Maleic Dialdehyde, MDA）含量，筛选出能有效保护冷冻精子的抗氧化剂以及最优组合。实验结果如下：
1. 用0.25ml细管冷冻保存大熊猫精液，解冻后精子活力、活率、质膜完整率和顶体完整率优于颗粒冷冻保存方法，两种方法差异虽不显著，但细管具有剂量标准，标记明显，不易受外界环境污染，解冻方便等优点，因此应采用细管冷冻保存方法；较M199而言，Ham’s F-10可以显著提高冷冻精子的质膜完整率和顶体完整率，所以Ham’s F-10更适合作大熊猫精液解冻液。
2. 精液解冻液中分别添加2 mmol/ml VC，0.2 mg/ml VE或0.50 mg/ml VB12时，可以较好地提高大熊猫冷冻-解冻后的精子质量、降低MDA含量。VE浓度为1.0mg/ml时，精子顶体完整率较低于对照组，VC和VE浓度为4 mmol/ml和1.0mg/ml时精子中MDA含量最高，说明高剂量的VC、VE促进了脂质过氧化反应；按照最适浓度联合添加VC、VE和VB12，对冷冻精子的保护效果好于VC+VE组。
3. 在大熊猫精液解冻液中单独添加SOD、CAT和GSH可以对冷冻精子起到保护作用，其中这三种抗氧化酶的浓度分别为50U/ml、200U/ml和5mg/ml时可以更好地提高冷冻-解冻后精子质量，降低MDA含量；按照上述浓度联合添加SOD和CAT对大熊猫冷冻精子的保护效果略好于SOD+GSH组。
总之，大熊猫精液最好使用0.25ml细管冷冻和Ham’s F-10解冻；解冻液中添加2 mmol/ml VC、0.2 mg/ml VE、0.50 mg/ml VB12或三者联合添加，解冻液中添加SOD、CAT和GSH的浓度分别是50U/ml、200U/ml和5mg/ml，或同时添加SOD和CAT，可以提高冷冻精液品质和冷冻精子的抗氧化损伤能力。本研究对促进大熊猫精液冷冻保存技术的进一步发展和抗氧化剂在精液冷冻保存中的进一步应用提供理论参考。