题目：辣根过氧化物酶热稳定剂的筛选及其作用机制研究

辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP, EC 1.11.1.7)是过氧化物酶家族研究最深入、应用最为广泛的一种酶。HRP可以作为组织合成和生物转化的试剂，还可以应用于酶分析、化学发光测试、免疫测定以及废水处理等方面。在这些应用中，HRP需要在不同的条件下进行催化反应，而这些环境通常不是酶发挥其天然功能的环境。影响酶在体外环境中发挥功能的一个主要限制因素是它的稳定性。所以，如何尽可能保持酶在体外环境的稳定性和催化效能是生物技术领域的一个极为重要的课题。目前已有很多用于提高HRP稳定性的方法，但这些方法在应用于一些需要长期保持酶的高活性的场合仍然具有一定的局限。本研究基于目前已有的研究成果和对酶的结构功能的认识，尝试用较为简便易行、廉价有效的方法来提高HRP在热胁迫下的活性和稳定性，以进一步提高HRP在非天然状态下的稳定性和使用效率。本文从金属盐和一些天然高分子化合物中筛选了HRP的热稳定剂，发现硫酸镁和明胶混合物能够显著提高HRP的热稳定性，可以应用于HRP的吸附固定。实验结果表明，在硫酸镁和明胶组成的酶稳定剂存在的条件下，HRP在50℃孵育80 h后仍能保持89%的活性，常温下存放90 d后可保持57%的活性，而未加稳定剂的对照样品中HRP的残留活性分别为30%和小于1%。通过对HRP的Soret带吸收光谱，色氨酸内源荧光，ANS荧光进行分析，揭示酶稳定剂可以明显降低在加热条件下HRP的变性程度，从而维持较为稳定的天然构象。这些实验结果支持了硫酸镁和明胶对于维持HRP在高温条件下的稳定性具有协同作用，是良好的酶稳定剂。
一、实验方法
1.  HRP活性测定方法：本研究采用HRP催化过氧化氢和四甲基联苯胺的氧化反应作为酶活性测试体系。四甲基联苯胺(TMB)在HRP作用下，可被H2O2氧化生成蓝色产物，在700 nm处有最大吸收，以此波长下产物生成量或吸光值的大小可确定酶的相对活性大小。经实验探索，发现H2O2浓度在0～2.25 μΜ，TMB浓度在0～250 μΜ范围内，0～10 μg∕mL的HRP的催化活力与TMB蓝色产物的生成速率具有良好的线性关系。
2. HRP热稳定剂的筛选：HRP干粉用双蒸水溶解（0.1 μg∕mL），与作为酶稳定剂的各组分以一定比例混溶后，于96孔板中点样，在加热或室温条件下的空气中存放。酶活性测定时，样品用双蒸水溶解，吸取样品溶液，与TMB和H2O2混和后于700 nm处测定反应反应进程曲线，以含有等量新配制HRP的反应体系为对照，计算酶的相对活性。
3. HRP吸收光谱（Soret Band）：用分光光度计在360～450 nm范围内扫描HRP溶液，记录402 nm处最大吸收值的变化。
4. HRP内源荧光光谱：用荧光分光光度计在310～490 nm范围内扫描酶溶液的内源荧光，激发光波长为295 nm，此时色氨酸在330 nm处有最大荧光值。
5. ANS荧光：用荧光分光光度计在400～600 nm范围内扫描外源荧光探针ANS在HRP存在下的发射光谱，激发波长为350 nm。ANS在与蛋白质结合后，最大发射波长发生兰移，荧光强度也随之改变，由此可反映蛋白质疏水区域外露的程度。
二、实验结果
1. HRP的热稳定剂：通过对十几种金属的氯化物，硫酸盐，以及一些高分子化合物和其他小分子化合物进行了实验，结果发现，一些金属的硫酸盐和明胶对HRP具有一定的热稳定作用。其中，以硫酸镁和明胶组成的复合稳定剂的作用最强，两者具有明显的协同作用。在50℃孵育80 h后仍能保持89%的活性，常温下存放90 d后可保持57%的活性，而未加稳定剂的对照样品中HRP的残留活性分别为30%和小于1%。
2. HRP卟啉中心的特征吸收光谱：含有卟啉结构的蛋白质在420 nm 附近的强吸收峰称为Soret带，本实验测得的HRP的Soret带最大波长在402 nm处。在无稳定剂存在的情况下，HRP 在经热处理后后，其Soret带吸收值明显下降，镁盐在此时对HRP的Soret带相关结构几乎无稳定作用，明胶有一定的稳定作用，而硫酸镁和明胶的混合物则能够在加热过程中保持HRP的Soret带特征吸收值不变，与新鲜配制的HRP样品基本上没有区别。
3. HRP内源荧光：未经孵育的HRP的色氨酸荧光在340 nm左右有一最大峰值，经孵育后，荧光峰发生红移，谱形发生变化，形成M型双峰，硫酸镁和混合稳定剂表现出一定的稳定相关结构的作用，而明胶与不加任何添加剂的HRP的光谱基本相同。说明硫酸镁和混合稳定剂具有稳定HRP分子结构，减小加热条件下色氨酸残基微环境的改变。
4. ANS荧光：ANS荧光结果表明，硫酸镁和混合稳定剂对加热条件下的HRP的分子结构有一定的稳定作用，能够降低HRP在热变性条件下的疏水区外露。这个结果与内源荧光测定结果相同。
三、结论
本研究的结果表明，以明胶为基质，在硫酸镁的协同作用下，HRP在常温和热胁迫环境下的稳定性得到了极大的提高。其作用的主要机制是对蛋白质三维结构的稳定。该稳定剂在HRP和其他酶的固定化，特别是吸附固定技术中可能具有广泛的应用前景。