题目：蛋白激酶A对血小板生理功能的调控作用及血小板糖蛋白GPIb-IX复合物体外研究模型的建立

糖蛋白（Glycoprotein，GP）Ibα表达于血小板质膜表面，其膜外N端序列含有von Willebrand因子（von Willebrand factor，VWF）等配体的结合位点。在高剪切条件下，GPIbα与暴露于受损血管内皮表面的VWF结合使得血小板粘附在受损血管壁形成血栓，起到止血作用。因此GPIbα的膜外功能区的酶切与血栓形成和止血紧密相关。储存的血小板或血小板受到刺激后，GPIbα发生外功能域酶切，但是其中的机制未明。在本研究中，我们探讨了蛋白激酶A (protein kinase A，PKA)在GPIbα酶切中的作用，结果表明长时间抑制血小板蛋白激酶A能够导致解离素-金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase, ADAM）17依赖的GPIbα酶切。血小板与PKA抑制剂（H89)长时间温育导致GPIbα剂量依赖性的被酶切。其酶切发生的程度明显大于钙离子载体或α－凝血酶介导的GPIbα酶切，然而前者血小板表面P-选择素的表达却明显低于后者。PKA抑制诱导的血小板GPIbα酶切能够被PKA激活剂（forskolin)反转，并且能够被膜透过性calpain抑制剂部分抑制。金属蛋白酶抑制剂GM6001或EDTA能够完全抑制H89诱导的GPIbα酶切，表明此条件下的酶切依赖于金属蛋白酶。时间依赖实验表明酶切开始于血小板与PKA抑制剂温育10分钟后，而且在30分钟时程度达到最大。受到PKA抑制剂长时间处理的血小板，其botrocetin诱导的聚集功能以及剪切力诱导的VWF粘附功能明显降低。本研究对于揭示血小板功能的负调控机制具有重要意义。除了GPIbα膜外功能域酶切，论文还论述了PKA在血小板促凝活性中的调控作用。血小板活化导致的微颗粒（microparticle, MP）释放以及磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine, PS）外翻能够为凝血酶的形成提供催化表面，因此被定义为血小板的促凝活性。有研究报道升cAMP试剂能够抑制激动剂诱导的血小板微颗粒释放和PS外翻，但是其中的机制未明。本研究显示，抑制血小板PKA基础活性能够导致血小板微颗粒形成和PS释放。升高胞内cAMP浓度的试剂（forskolin)能够抑制凝血酶加胶原诱导的微颗粒形成和PS暴露，同时能够明显减低钙离子载体诱导的微颗粒释放。并且PKA抑制剂H89能够反转forskolin对激动剂诱导的微颗粒释放和PS暴露。PKA抑制剂诱导的MP形成能够被calpain抑制剂剂量依赖的减低。并且forskolin能够完全抑制凝血酶加胶原诱导的calpain活化。因此，PKA能够调控血小板的促凝活性，并且PKA抑制诱导的微颗粒释放依赖于calpain的激活。GPIb-IX复合物表达于血小板质膜表面，通过起始血小板在受损血管壁上的粘附而参与血栓形成和止血。有关GPIb-IX的研究结果大多数直接来自于血小板或外源表达GPIb-IX复合物的细胞，目前为止还没有体外模式膜系统能够用于该复合物结构和功能的研究。磷脂双层纳米盘由一小块磷脂双层以及包裹在磷脂外侧的膜支架蛋白（membrane scaffold protein，MSP）组成，是目前用于膜蛋白研究的十分具有吸引力的模式膜。因此，本研究从人血小板中纯化出GPIb-IX复合物，将其重组于磷脂双层纳米盘，并检测其配体结合功能。纯化的GPIb-IX复合物与MSP及磷脂以一定比例混合，组装后由分子筛层析柱分析和分离。GPIb－IX与MSP同时洗脱表明组装的成功。重组于纳米盘的GPIb-IX复合物能够结合多种构像敏感抗体，并以0.73 ± 0.07 nM的亲和力在botrocetin存在的条件下与VWF结合。Ram.1是抗GPIbβ膜外结构域的单克隆抗体，并能够抑制血小板和转染了GPIb-IX复合物的细胞的VWF配体结合功能，提示GPIbβ的膜外结构域可能直接参与GPIbα的配体结合功能。我们用这一体外膜系统验证这个假设。结果表明虽然Ram.1能够与重组于纳米盘的GPIb-IX复合物结合，但是对VWF的结合功能完全没有影响。而且，重组于纳米盘的GPIb-IX复合物与GPIbα的片段glycocalicin具有相同的VWF结合功能。因此，重组于磷脂双层纳米盘的GPIb-IX复合物具有正常的配体结合功能。并且从这一体外模型得到的结果提示，血小板或细胞内Ram.1对VWF结合功能的抑制作用并不直接依赖于GPIbβ的膜外结构域。