题目：红色荧光蛋白DsRed的毒性研究和Super-folder GFP BiFC

以绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP为代表的自发荧光蛋白是活体荧光探针的重要成员，在细胞生物学、分子生物学、干细胞、医学等领域都有广泛的应用，成功标记的靶标覆盖了核酸、蛋白，各类细胞、组织、器官甚至整个生物体。DsRed是最早发现的红色荧光蛋白，自2000年以来对DsRed作为荧光探针的缺点进行了很多改进工作，但其对细胞的毒性仍然是作为标记探针的明显缺陷。本文通过研究DsRed毒性的分子机制发现DsRed对HeLa细胞的毒性与下调抑凋亡蛋白Bcl-xL的翻译有关。此外，鉴于荧光蛋白在蛋白质相互作用研究领域应用广泛，本文将super-folder GFP 拆分构建成双分子荧光互补系统，用定点突变的方法降低系统的背景荧光和假阳性取得成功。以绿色荧光蛋白Wasabi和红色荧光蛋白DsRed 为材料构建双荧光共定位系统，经验证检测蛋白质相互作用效果显著。1、红色荧光蛋白DsRed的毒性研究从珊瑚Discosoma sp中分离得到红色荧光蛋白DsRed，以其不同的荧光颜色和种属来源引起荧光探针领域的广泛关注。进一步的研究发现DsRed较GFP具有更长的激发波长和发射波长，更高的量子产额，耐光漂白性和更宽的pH适应范围(4.5-12)，是科学研究和产业应用的理想荧光探针。但是DsRed也有不足，如发光团成熟时间过长，易于形成低聚物以及对细胞具有毒性等。目前，针对其发光团成熟时间长和易于低聚化等不足，利用突变的方法已经开发出多种优化的突变体，但对其毒性的机制研究和低毒性改造方面的工作却仍不理想。以往的研究认为DsRed毒性的原因是由于聚集影响真核细胞和原核细菌中有关的内源蛋白折叠而造成的。但我们的研究发现在HeLa细胞中，DsRed的毒性与抑制抑凋亡蛋白Bcl-xL的翻译有关。同时，过量表达Bcl-xL可以显著的降低DsRed引起的细胞毒性。但是，从发光海葵Entacmaea quadricolor中分离得到的红色荧光蛋白Turbo RFP却不会影响Bcl-xL的表达。这些发现说明来源不同的红色荧光蛋白毒性的机制有所不同。上述研究对改进DsRed及其突变体，开发低毒性的红色荧光蛋白具有重要的意义。2、Super-folder GFP 的双分子荧光互补系统(BiFC)的定点突变改造双分子荧光互补系统(BiFC)在蛋白质-蛋白相互作用(Protein-protein interaction，PPIs)领域具有广泛的应用。BiFC以其快捷、迅速、能够即时观察到活细胞内的蛋白质相互作用而倍受青睐。但BiFC的一个普遍的不足就是被拆分的荧光互补系统的两个片段，经常自发的相互结合形成完整的活性蛋白而产生可见荧光，造成检测中的假阳性结果。super-folder GFP(sfGFP)是绿色荧光蛋白GFP的突变体。在本研究中被拆分为sfGFPN和sfGFPC构建成荧光互补系统。sfGFPN和sfGFPC从sfGFP的214和215的氨基酸位点处被拆分开。通过定点突变PCR的方法对sfGFPC片段进行突变改造，降低阴性对照的背景荧光信号。经过定点突变改造后的得到的突变体sfGFP(m12)可以显著降低双分子荧光互补系统的阴性对照的背景荧光强度，大大克服了双分子荧光互补系统自组装和自激活的不足，为具有类似缺点的双分子荧光互补系统备选蛋白提供了一种可行的改进方法。3、绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP双荧光共定位系统荧光共定位是细胞分子生物学中常用的方法之一，自发荧光蛋白是活体内荧光共定位方法的重要组成部分。从发光水母victoria 中分离得到的绿色荧光蛋白GFP和从珊瑚Discosoma sp中分离得到的红色荧光蛋白DsRed是自发荧光蛋白典型的代表。本研究开发出一种双荧光共定位检测系统，该系统将核仁定位信号NoLs和出核信号ABL分别连接到DsRed和Wasabi GFP的N端和C端，具有定位信号的GFP和RFP的待检测蛋白对就可以分别在细胞核内和细胞核外表达，伴随蛋白对的相互作用，荧光共定位的现象就会产生在细胞内特定的区域，使绿色荧光蛋白Wasabi和红色荧光蛋白DsRed在细胞内表达发生荧光共定位和蛋白的空间位移变化。以抑凋亡蛋白Bcl-2和Bak BH3短肽作为蛋白对测试该系统，荧光共定位现象明显，系统灵敏可靠。