题目：超声结合原卟啉Ⅸ对人乳腺癌细胞MCF-7损伤作用及机制研究

声动力学疗法（sonodynamic therapy，SDT）为日本学者Umemura等在光动力学疗法基础上首次提出的一种抗肿瘤方法和理论。该疗法是用一定强度和频率的超声波辐照肿瘤部位，结合声敏剂在肿瘤组织的特异富集性与超声自身靶向性和极强的组织穿透性，从而对肿瘤组织产生不可逆的损伤，达到抗肿瘤效应。最早应用于声敏剂的是血卟啉（haematoporphyrin derivative，HpD）及卟啉类化合物，原卟啉（protoporphyrinⅨ，PpⅨ）属于卟啉类化合物的一种，已有研究表明超声与其联合作用具有明显的抗肿瘤效应。以往对PpⅨ-SDT抗肿瘤作用的研究主要集中在诱导凋亡方面，近年来，随着对另一种程序性细胞死亡方式——细胞自噬性死亡研究的不断深入，自噬在抗肿瘤中的作用已成为当今研究的热点。本课题组前期在SDT诱导细胞凋亡研究中观察到细胞自噬的部分形态学特征，且发现SDT抗肿瘤中存在多种细胞死亡模式。本论文通过研究一定实验参数条件下SDT对乳腺癌细胞MCF-7的损伤效应，并对其作用机制进行了初步探讨，可补充和完善SDT的抗肿瘤理论，为SDT的临床治疗提供新的思路和对策。
本论文研究以教育部高等学校博士学科点专项科研基金“声动力诱导乳腺癌细胞自噬性死亡机制研究”为依托。在前期研究的基础上，选用离体培养的人乳腺癌细胞系MCF-7为细胞模型，通过多种细胞分子生物学研究技术手段和方法，探讨一定的声动力参数处理对人乳腺癌MCF-7细胞的杀伤效应以及诱导细胞自噬的分子机理，目前所取得的实验结果如下：
1.原卟啉Ⅸ在0-400 nmol/L浓度范围内与其荧光强度有良好的线性关系，PpⅨ在MCF-7细胞中的代谢过程是动态变化的，浓度分别为0.5 μM，1 μM，2.5 μM的原卟啉Ⅸ在MCF-7细胞中孵育2.5 h后其富集量都达到最大。
2.乳腺癌MCF-7中原卟啉Ⅸ与线粒体的共定位研究发现，原卟啉Ⅸ受激发后发出的红色荧光与线粒体标记性探针（MitoTracker Green）的绿色荧光有很好的重叠，PpⅨ与线粒体发生共定位，提示线粒体可能为SDT作用的主要靶点。
3.单纯PpⅨ、单纯超声以及超声结合PpⅨ对MCF-7细胞的损伤研究发现，当原卟啉IX浓度小于2.5 μM时，其对MCF-7细胞几乎没有损伤作用，PpⅨ浓度为2.5 μM时，对细胞有轻微的损伤作用，与对照组相比差异显著，原卟啉Ⅸ浓度增大到5 μM时，产生了明显的增殖抑制效应，PpⅨ对MCF-7细胞的损伤作用表现出浓度依赖性效应；强度为1 W/cm2、2 W/cm2、3 W/cm2、4 W/cm2的超声处理MCF-7细胞时，发现细胞活力随着声照强度的增加而下降，其对声照强度的敏感阈值为3 W/cm2；强度为3 W/cm2 的超声结合2.5 μM的PpⅨ作用于MCF-7细胞，表现出明显的协同损伤效应。
4.PpⅨ-SDT作用MCF-7后的形态学变化的研究结果显示，与对照组相比，单纯PpⅨ组对细胞的损伤不明显，单纯超声组细胞贴壁能力下降，漂浮细胞增多，SDT组细胞数目和形态发生明显变化，细胞碎片增多，较单纯超声组和单纯药物组损伤严重。
5.用流式细胞仪分析线粒体的膜电位变化，发现超声结合原卟啉Ⅸ组对MCF-7细胞线粒体膜电位影响较大。与对照组相比，单纯原卟啉Ⅸ对线粒体膜电位影响不大。超声组和超声结合PpⅨ组线粒体膜电位下降细胞数目均增多，且超声激活PpⅨ组显著高于单纯超声组。
6.通过自噬的特异性染料吖啶橙检测自噬的发生，观察到超声激活PpⅨ组相对于对照组的细胞胞浆中有大量酸性自噬泡出现，提示SDT可诱导人乳腺癌细胞MCF-7自噬活性增强。
7.免疫印迹（Western Blotting）检测自噬相关蛋白的表达变化，发现SDT处理组自噬标记分子LC3由Ⅰ型向Ⅱ型的转化增加，而且自噬相关蛋白Vps34，Cathepsin B，UVRAG等表达量均明显上调，提示超声结合PpⅨ诱导MCF-7细胞发生了自噬。