题目：溶菌酶淀粉样纤维化的分子机理

迄今为止，已确认有20多种人类疾病与蛋白质或者多肽淀粉样纤维化有关，如Alzheimer’s疾病、疯牛病、帕金森病，家族性血管淀粉样变性，溶菌酶淀粉样变性疾病等等。最近的研究发现，一些与疾病不相关的蛋白质和多肽，如Aβ肽、胰岛素、溶菌酶等，在一定的环境下，如低pH、加热、搅拌、加入助溶剂或者变性剂等，同样可以自组装形成纤维结构，表现出淀粉样纤维的特性。因此，可以说淀粉样纤维化是所有蛋白质的一个共性。而蛋白质是生物体的主要构成部分，是一切生命的物质基础，它在生物的生命活动中起着重要作用，因此对蛋白质淀粉样纤维化分子机制及其相关疾病的诊断治疗已成为目前的重要科学问题之一。
蛋白质淀粉样纤维化是一个复杂的过程，单体经自组装形成一系列大小形状不同的中间体，如寡聚体﹑原纤维，最终形成纤维。通常情况下，淀粉样纤维会聚集在各种器官或组织的细胞膜上，引发细胞或组织功能性障碍，从而导致相关病症的发生。目前对淀粉样纤维化的形成机理和致病机制仍不是很清楚，因此进一步的探索是十分必要的。
本文选用了鸡蛋清溶菌酶为研究对象，探索蛋白质二硫键和巯基化合物在溶菌酶淀粉样纤维化中的作用。第一部分，通过对溶菌酶二硫键进行化学标记，追踪溶菌酶分子在纤维化过程中的构象变化，如α螺旋﹑β-折叠﹑疏水区及二硫键的暴露等；第二部分，利用含巯基的小分子化合物谷胱甘肽﹑半胱氨酸作为抑制剂，探索蛋白质二硫键和巯基化合物在溶菌酶淀粉样纤维化过程中的作用。
实验主要方法和结果
第一部分
1.?????? 溶菌酶纤维生长的检测
采用荧光探针技术和圆二色谱检测溶菌酶在淀粉样纤维化过程中的生长和构象变化。如ThT（Thioflavin T）荧光检测β折叠、ANS（1-anilino- naphthalene 8-sulfonate）荧光检测表面疏水区改变情况。结果表明，溶菌酶在纤维化过程中主要伴随着a-螺旋减少，同时β-折叠增加，疏水区域逐渐暴露，其纤维生长曲线呈“s”型，具有成核-延伸-形成纤维的动力学特征。
2.?????? 纤维化过程中二硫键的标记及测定
通过DTT将二硫键还原为自由巯基，并分别用巯基封闭试剂NEM（N-ethylmaleimide），IAM（Iodoacetamide）对溶菌酶分子表面和内部的自由巯基进行标记，然后采用MALDI-TOF-MS分析标记序列，以此追踪溶菌酶分子在纤维化过程中二硫键的暴露次序。 实验结果表明，在溶菌酶在淀粉样纤维化过程中，其64位﹑115位和127位半胱氨酸优先处于分子外部，6位﹑30位次之， 76位﹑80位和94位在纤维成熟后期才暴露出来。对肽链的疏水性分析表明，优先暴露的半胱氨酸处于蛋白质的亲水区域，而纤维生长过程中逐渐外露的半胱氨酸则处于疏水区，与ANS荧光检测表面疏水区变化的结果相符。
第二部分
1. 巯基试剂对溶菌酶纤维化的影响
采用ThT荧光检测淀粉样纤维的生长。结果表明，还原型谷胱甘肽、半胱氨酸﹑DTT（Dithiothreitol）对溶菌酶淀粉样纤维的形成具有抑制作用，抑制作用与浓度呈正相关。与之比较，氧化型谷胱甘肽对纤维的生长没有影响，说明巯基在抑制溶菌酶淀粉样纤维化具有关键的作用。
采用ANS荧光检测纤维疏水性的暴露情况，结果表明，还原型谷胱甘肽可以延迟溶菌酶分子的疏水区外露。
圆二色谱可用于检测蛋白质纤维化过程中二级结构变化情况，结果表明，还原型谷胱甘肽可使溶菌酶α螺旋含量明显增加；在孵育过程中，同样可观察到溶菌酶α螺旋下降、β-折叠增加的总体趋势，符合淀粉样纤维化的动力学特征。
2.纤维形态的检测
主要采用偏光显微镜和透射电子显微镜检测纤维形态。成熟的纤维在偏光显微镜下具有特征的亮黄色；而在透射电镜下，可观察到典型的丝状纤维结构。在还原型谷胱甘肽的存在下，纤维的形成受到了抑制。当还原型谷胱甘肽浓度较高时，溶菌酶不能形成典型的纤维结构。
3.溶血试验检测溶菌酶纤维的毒性
由于还原型谷胱甘肽对溶菌酶纤维化有抑制作用，并可导致形成典型纤维结构的趋势降低，所以还原型谷胱甘肽能够降低溶菌酶纤维的细胞毒性作用，并与浓度呈正相关，与ThT荧光检测的结果相符合。
4. 还原型谷胱甘肽抑制溶菌酶纤维化的分子机理
电泳对比实验证实，还原型谷胱甘肽可以促进溶菌酶的水解。这种水解作用使得溶菌酶形成分子量较小的多肽，抑制了分子的自组装方式和进程。另外，巯基化合物还可能通过与溶菌酶分子的二硫键发生相互作用，从而抑制的纤维生长。
结论：溶菌酶在本文的实验条件下可以形成淀粉样纤维，在纤维化过程中，伴随着溶菌酶分子的α螺旋减少，β-折叠增加，以及疏水区域外露。利用双重化学标记-质谱进行分析，证实溶菌酶在形成淀粉样纤维过程中，分子的疏水区随着纤维化进程而逐渐外露，从而使淀粉样纤维表面疏水性增加，细胞毒性增强。含巯基的小分子化合物，如还原型谷胱甘肽、半胱氨酸和DTT对溶菌酶淀粉样纤维的形成具有抑制作用，抑制作用与浓度呈正相关。较高浓度下，溶菌酶不能形成典型的纤维结构，细胞毒性作用也随之降低。巯基化合物通过促进溶菌酶水解，以及与溶菌酶分子的二硫键发生相互作用，抑制了溶菌酶分子的自组装方式和纤维化进程。