题目：人泡沫病毒GAG、ENV蛋白原核表达与抗血清的制备及初步应用

泡沫病毒(foamy virus, FV)属于逆转录病毒科(Retroviridae)泡沫逆转录病毒亚科(Spumaretrovirinae)的泡沫病毒属。人泡沫病毒(human foamy virus, HFV)首次于1971年从肯尼亚鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中分离，HFV没有明显的致病性，最直接的证据是感染FV的实验工作者一直不表现临床症状。HFV有较大的基因组，宿主细胞广泛，能建立持续性的感染而不产生任何症状，因此HFV是构建基因转移载体的理想材料。本实验室在前期研究中已成功构建了系列复制缺陷型HFV载体，进行了神经系统疾病和抗HBV基因治疗的研究。在HFV基因转移载体研究中，对其感染宿主细胞效率需要进行蛋白水平的检测，因此本研究采用基因工程技术克隆、表达、纯化HFV的GAG(group specific antigen)、ENV(envelop)蛋白，并制备其抗血清，为HFV基因转移载体蛋白水平的定性、定量检测提供支持，同时为HFV结构蛋白研究奠定基础。
本研究是从HFV原病毒全长克隆pHSRV13质粒为模板，根据已报道的 gag基因和 env 去除穿膜蛋白的C端穿膜区基因开放阅读框设计引物，PCR扩增产物和表达载体分别经过EcoR I和Xho I双酶切后纯化、连接，然后将连接产物转化至宿主菌E.coli DH5a，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，再进行EcoR I和Xho I双酶切鉴定后进行测序。构建了原核表达载体分别转化到E.coli BL21 Star  (DE3) 表达菌，分别用IPTG诱导表达GAG和ENV两种融合蛋白，产物经SDS-PAGE分析其表达形式，经His•Bind亲和层析柱纯化GAG、ENV重组蛋白，之后用Bradford法测定纯化后蛋白质浓度。进行SDS-PAGE分析后切取GAG和ENV融合蛋白条带，再与PBS研磨后注射新西兰大白兔诱导产生免疫应答并制备兔抗人GAG和ENV蛋白抗血清，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗血清滴度，采用Western blot印迹法和间接免疫荧光检验抗血清特异性。取得的主要研究成果如下：
1、PCR扩增 gag 基因约2.0kb，env 基因约3.4kb，对重组子的菌落PCR和双酶切鉴定结果正确。测序结果经过ClustalW2软件分析，克隆片段与Genbank发表的HFV原病毒全长克隆pHSRV13序列相符，说明成功构建融合有多聚组氨酸(His)标签的原核表达质粒pET-32a-gag和pET-32a-env。
 2、构建的表达载体转化至大肠杆菌中，IPTG诱导均获得高效表达，获得相对分子质量M r约90 000的GAG融合蛋白，及相对分子质量M r约130 000的ENV融合蛋白；其中GAG蛋白在不同的温度、时间和IPTG浓度下诱导均主要以包涵体形式存在，ENV蛋白主要以可溶性形式存在；分别按照His•Bind® Quick 900 Cartridges操作说明书进行纯化后获得高纯度融合蛋白。
3、切胶免疫新西兰大白兔后得到抗血清，ELISA显示抗血清具有高效价，GAG抗血清效价可达1：1 024 000以上，ENV抗血清效价可达1：64 000以上，Western blot检测证实该抗血清能与原核表达目的蛋白发生特异性结合。
4、用制备的GAG蛋白抗血清对pHSRV13转染真核细胞进行间接免疫荧光和Western blot检测，证实抗血清具有结合病毒产生的GAG蛋白的活性。
研究结果显示本研究达到了预期的目标，获得了高效价、具有较好免疫活性的抗血清。本实验为进一步进行HFV载体的检测和HFV结构蛋白的研究奠定基础。