题目：过表达番茄PS基因并RNA干扰COMT基因对丹参有效成分含量的影响

丹参为唇形科多年生草本植物，以根及根茎入药，对心脑血管疾病、癌症等的治疗具有显著的功效。丹酚酸B等水溶性的酚酸类化合物和脂溶性的丹参酮类化合物是丹参的两大类主要的活性成分。近年来，随着丹参需求的日益扩大和野生资源的逐渐减少，提高丹参中活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参资源开发中亟待解决的关键问题之一。抑制竞争途径关键酶基因的表达，过表达影响目标产物合成途径的调控基因是提高药用植物活性成分的有效途径。本研究通过在丹参中过表达参与植物内源茉莉酸合成的原系统素基因(PS)并同时干扰抑制酚酸类合成分流途径木质素合成的关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因（COMT）的表达，以获得丹酚酸B及丹参酮类活性化合物含量提高的丹参株系，为丹参分子育种奠定基础。
主要研究内容与结果如下：
1．选取番茄PS基因的开放阅读框作为靶片段，构建了原系统素基因过表达载体pCAMBIA1302/PS；选取丹参COMT基因编码区中长为340bp的片段，构建了pKANNIBAL/COMT的干涉载体；用SacI及PstI双酶切将干涉框连接到pCAMBIA1302/PS载体上，获得同时过表达PS基因并干涉COMT基因的植物表达载体pCAMBIA1302/PS+pKANNIBAL/COMT。用农杆菌介导的叶盘转化法转化丹参，经过潮霉素的筛选，得到不同的转基因植株。
2．用PCR方法检测获得5个外源基因稳定整合到丹参基因组的阳性株系；用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测了阳性株系中PS基因和COMT基因的表达水平，结果显示，PS+COMT-2，PS+COMT-3，PS+COMT-8，PS+COMT-13株系中PS基因的表达得到了显著上调且COMT基因的表达显著下调。
3．用HPLC检测转基因阳性植株中丹参活性成分含量的变化，结果显示迷迭香酸和丹酚酸B等水溶性活性成分以及隐丹参酮等脂溶性成分的含量较对照株系均有显著性升高。其中，250 d的转基因株系PS+COMT-2中迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量较对照株系相比分别提高了1.4倍、1.6倍、3倍、2.5倍。
4．采用组织化学染色、光谱、色谱等方法检测转基因植株PS+COMT-2的木质素含量变化结果显示：其茎横切片中褐色沉淀物比较明显且结构疏松；Klason木质素含量较对照植株有所下降，酸可溶性木质素含量上升；其中G-木质素含量明显下降，而S-木质素的含量很低。
5．用实时荧光定量PCR检测转基因植株PS+COMT-2中丹参活性成分合成途径中关键酶基因的表达，结果显示，迷迭香酸合成途径中的苯丙氨酸解氨酶基因2、肉桂酸-4-羟化酶基因、4-香豆酸辅酶A连接酶基因、肉桂酰辅酶A还原酶基因、迷迭香酸合成酶基因和羟苯基丙酮酸还原酶基因的表达水平较对照株系有一定的提高，丹参酮类合成途径中的1-去氧木糖-5-磷酸合成酶基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因、柯巴基焦磷酸合酶基因的表达水平也有明显的提高。