题目：丹参中过表达番茄原系统素基因的研究

丹参在我国境内广为种植，以干燥根及根茎入药。作为一种传统中药材，丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效，主要用于治疗月经不调、经闭痛经、心烦不眠、肝脾肿大和心绞痛等。丹参的有效成分主要分为两大类：脂溶性二萜醌类和水溶性酚酸类化合物。系统素(systemin)是植物中第一个被发现的多肽类激素，和茉莉酸在同一信号通路中。系统素可诱导茉莉酸的合成，茉莉酸及其衍生物作为一类重要的植物信号分子，能够诱导植物体启动内在防御机制，诱导并调节植物中各种伤害反应或防御反应基因的表达，有效刺激植物次生代谢产物的积累。本研究在丹参中过量表达了番茄原系统素基因（prosystemin，PS），通过系统素的过表达提高丹参内源茉莉酸的含量，进而促进丹参中防御机制和木质素等次生代谢产物的合成，为提高丹参抗性、改良丹参品种等奠定基础。
1．以番茄PS基因编码区（603 bp）作为靶片段，构建了丹参PS基因过表达载体pCAMBIA1302/PS；用农杆菌介导的叶盘转化法转化丹参，经过潮霉素的筛选，得到了20个转基因株系。
2．利用PCR检测转基因株系中PS基因的整合情况，结果显示，20个抗性株系经特异性引物扩增后有8个株系得到一条与目标扩增片段大小相一致的特异性条带，证明外源PS基因已整合到丹参基因组中。野生型的对照株系总DNA扩增后没有特异性条带的出现。利用半定量和定量PCR检测转基因株系中番茄PS基因的表达水平，结果显示PS-3和PS-5株系中原系统素基因的表达量显著提高。
3. 采用组织化学染色、光谱、色谱等多种检测技术对阳性转化株系中木质素的含量进行分析，结果表明，与野生型相比，阳性转化株系中总木质素的含量呈不同程度的提高，PS-3株系中G型和S型木质素单体的含量均显著高于野生型植株，其中S型木质素的含量提高最明显，是对照株系的2.2倍。
5.对转基因株系根的甲醇提取物进行了高效液相色谱分析，结果显示隐丹参酮的含量在转基因株系中比野生型高了约2倍，丹参酮ⅡA的含量在转基因株系中比野生型高了约3倍。进一步对PS-3株系的甲醇提取物进行体外抗菌活性实验，测定其最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，实验结果表明PS-3株系提取物对所试9种细菌均有抑制作用，并且抑菌活性显著优于野生型对照株系的提取物,推测这种抑菌活性的提高可能是由于丹参酮类化合物含量的提高造成的，是过表达番茄PS基因的间接结果。

6. 利用实时荧光定量PCR检测了转番茄PS基因株系中木质素合成关键酶基因咖啡酰辅酶A还原酶(COMT)和肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）以及丹参脂溶性代谢途径中关键酶基因的表达。结果显示，在丹参中过表达番茄PS基因使COMT和CCR基因的表达也显著上调，其中COMT的表达提高了2.5倍。丹参酮合成相关基因1-去氧木糖-5-磷酸合成酶基因（DXS）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（HMGR）、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因（GGPPS）、法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)，柯巴基焦磷酸合酶基因（CPS）的表达水平有明显的提高。