题目：高速逆流色谱反胶束体系分离蛋白和多肽

本文以标准蛋白质的混合物、杏仁降压肽为研究对象，采用高速逆流色谱对其进行分离。由于分离对象都具有生物活性，所以选择能够提供温和环境的溶剂体系，以保护生物大分子的活性。能够满足此条件的溶剂体系为：双水相体系，反胶束体系。利用双水相体系逆流色谱进行分离蛋白已有很多报道，但鲜见有关采用高速逆流色谱反胶束体系分离蛋白、多肽的研究报道。本文从流动相等度分离蛋白混合物、流动相梯度分离蛋白混合物、分离纯化杏仁降压肽三方面进行了探索性的研究，并且采用高效液相色谱法对分离开的蛋白质纯度进行了分析。
本论文包括5个部分：
1. 综述
首先从高速逆流色谱的工作原理、优点、两相溶剂体系的选择、发展现状四个方面对高速逆流色谱的研究概况进行了综述；然后就反胶束体系形成与结构、种类、萃取机理及影响因素、此体系在蛋白、多肽上的应用现状进行了总结；接着对几种常见标准蛋白质的结构、功效及其分离纯化方法做了概述；最后对生物活性肽功效、分离纯化技术进行了简要概述。
2. 高速逆流色谱反胶束体系等度分离混合蛋白
采用高速逆流色谱法，选用0.02 mol/L AOT的正己烷溶液(0.5 ml Span80)作为溶剂体系的固定相，选用一定PH值的缓冲液作为流动相，在流动相等度的情况下分离混合蛋白。在pH=6.97，0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L KCl)和pH=6.00，0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.1 mol/L KCl)等度的情况下，分别进样牛白蛋白与胶原蛋白的混合物、牛白蛋白、胶原蛋白，然后比较谱峰的出峰时间，从而确定为共流出的关系。类似的在pH=9.00，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L KCl)等度的情况下对牛白蛋白和血红蛋白的混合物进行研究，结果相似。
3. 高速逆流色谱反胶束体系梯度分离蛋白混合物
采用高速逆流色谱法对牛白蛋白与溶菌酶的混合物进行分离研究，通过对比十二种反胶束体系其固定相保留率的高低，选择AOT+Span80/正己烷/水作为本实验半制备型高速逆流色谱的两相溶剂体系，正己烷溶液做固定相，一定pH值缓冲盐的水溶液做流动相。本文利用固定相流失产生噪音信号的大小确定500 ml正己烷中加0.5 ml Span80；通过单因素优化法优化试验所得最佳分离条件为：流动相流速为2.0 ml/min，仪器转速为650 rpm，一次分离流动相为pH=8.00，0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L KCl)，二次分离流动相为pH=11.95 ，0.05 mol/L Na2HPO4-NaOH缓冲液(0.8 mol/L KCl)。历经两次分离所得馏分，通过高效液相色谱的分析，结果如下：一次馏分为牛白蛋白，其纯度为94.3%；二次馏分为溶菌酶，其纯度为96.6%。
4. 高速逆流色谱法反胶束体系分离纯化杏仁降压肽
采用95 ℃热水去皮，干燥后粉碎，用正己烷脱脂两次，酸提碱沉提取蛋白，用碱性蛋白酶水解成多肽，超滤膜分离得到1000 Da以下杏仁降压肽。采用高效液相色谱法对其进行初步分离，可以看出其复杂性。然后运用高速逆流色谱对其进行分离纯化，仍然选用上述AOT/Span80/正己烷/水反胶束体系为溶剂体系，流动相为pH=5.00，0.05mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液时得到三个峰的一次分离图，用pH=10.00，硼砂---NaOH 缓冲液进行二次分离，出现明显的谱峰，说明反胶束体系对复杂的杏仁降压肽混合物有较好的分离功效，但是试验的重现性不好。
5. 研究总结
主要对研究内容进行总结，并对其进行展望。