题目：柿叶黄酮的体外抗氧化活性及对小鼠急性肝损伤保护作用的研究

生物氧化是为需氧细胞的生命活动提供能量的过程。在正常生理状况下，氧化过程不断产生以氧为来源的自由基，如O2-·，·OH等，人们称之为活性氧（reactive oxygen species，ROS），我们机体内存在着一系列的酶系统和非酶系统不断地对自由基进行清除，从而保护细胞、组织免遭氧化损害，但在病理情况下，自由基产生过多会引起体内抗氧化体系不足或耗竭，氧化物和抗氧化物的平衡失调，引发氧化应激，诱发各种疾病，如癌症、衰老、肝硬化、风湿性关节炎、糖尿病以及神经组织退化疾病等。大量研究表明，合理服用一些抗氧化剂或自由基清除剂，可有效减轻自由基对机体的损伤，预防此类疾病的发生。上个世纪，一些人工合成的抗氧化剂如二叔丁基羟基甲苯（BHT）、没食子酸丙酯（PG）、叔丁基羟基茴香醚（BHA）和特丁基对苯二酚（TBHQ）等被广泛应用于食品工业领域，但其安全性受到人们的置疑，而天然抗氧化剂以其来源广、安全性高、抗氧化活性强等优点倍受人们青睐。因此，开发更多更好的天然抗氧化剂具有重要的现实意义。
本文综述了柿叶资源概况、柿叶的化学成分及柿叶中主要成分黄酮类化合物的药理作用，测定了柿叶纯化物中槲皮素和山奈酚的含量，研究了柿叶粗提物和纯化物的体外抗氧化能力以及纯化物对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用。通过以上研究，以期为开发和利用柿叶资源提供参考和实验依据。实验主要分四部分来进行：
第一部分：柿叶黄酮（flavonoids of persimmon leaves，PLF）的提取和纯化。柿叶干燥粉末80 g，70%乙醇，提取温度85℃，提取次数2次，料液比1﹕15，提取时间分别为4 h和2 h，合并提取液，6000 r/min离心10 min，上清液50℃减压浓缩，50℃烘干，得固体粉末状柿叶总黄酮粗提物PLF。将PLF粗提液依次用石油醚（petroleum ether）、氯仿（chloroform）、乙酸乙酯（ethyl acetate）、正丁醇（n-butanol）萃取3次，移除石油醚，其余各相萃取液在旋转蒸发仪上减压浓缩，将以上浓缩物在50℃烘箱中烘干称重，计算氯仿相（chloroform fraction，CF）、乙酸乙酯相（ethyl acetate fraction，EAF）、正丁醇相（n-butanol fraction，BF）及余相（surplus fractions，SF）得率及其黄酮的含量及纯度。
第二部分：HPLC分析测定EAF（纯度为81.06%）中槲皮素和山奈酚的含量。以SinoChrom ODS-BP （250 × 4.6mm，5μm）为色谱柱；甲醇 - 0.4%磷酸溶液梯度洗脱，0 ～ 30 min内甲醇浓度由35% ～ 60%；流速为1 mL/min；紫外检测波长：360 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。
第三部分：EAF和PLF体外抗氧化性能比较研究。采用DPPH法测定了PLF和EAF对1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）的清除能力；用NBT-NADH-PMS体系测定PLF和EAF对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用；用Fenton法测定PLF和EAF对羟自由基（·OH）的清除能力；测定了PLF和EAF的还原能力以及采用Fe2+诱导的脂质过氧化反应对比分析了PLF和EAF的抗氧化能力。
第四部分：EAF对CCl4致小鼠急性肝损伤保护作用的研究。采用不同浓度的EAF盐溶液灌胃7 d，1次/日，末次给药3 h后腹腔注射0.1% CCl4（20 mg/kg），建立小鼠急性肝损伤模型。造模24 h后处死小鼠，测定不同剂量的EAF对血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（AKP）活性，肝超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量的影响，同时对肝组织进行病理学检查。
主要的实验结果如下：
1. PLF的提取及纯化：经提取得粗黄酮固体粉末质量为18.67 g，粗黄酮的得率为23.34%，总黄酮的含量为4.96%，黄酮纯度为22.17%；PLF经纯化后各相提取物得率SF（10.53%）> BF（3.00%）> CF（2.94%）> EAF（1.53%）；各相黄酮含量为EAF（1.24%）> BF（1.02%）> SF（1.00%）> CF（0.39%）；黄酮纯度为EAF（81.06%）> BF（34.10%）> CF（13.10%）> SF（9.46%）。
2. HPLC分析：槲皮素和山奈酚进样量在0.04 ～ 0.60 μg的范围内均有良好的线性关系，相关系数均为0.9981（n = 6），槲皮素和山奈酚的平均回收率（n = 6）分别为99.47%和102.7%，RSD值分别为0.903%和0.469%。EAF中槲皮素和山奈酚的平均含量分别为97.52 ± 2.30 mg/g 和103.6 ± 3.73 mg/g。
3. PLF和EAF体外抗氧化活性研究：纯化后的EAF较PLF有更强的清除羟自由基的能力，清除DPPH·、O2-·和·OH的IC50分别15.9 μg/mL、59.0 μg/mL、8.35 μg/mL，此外，EAF表现出较强的还原力和抑制脂质过氧化能力（IC50 = 82.6 μg/mL）。
4. EAF对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的保护作用：不同剂量的EAF均显著地降低血清中ALT、AST、AKP值，增强肝中SOD、GPx、CAT的活性，降低肝组织匀浆中MDA的含量，减轻CCl4对肝脏细胞的病理损伤。