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问题:

题目:经NGR肽段修饰的表达Arresten的腺病毒载体的构建

关键词:腺病毒载体,NGR肽段,衣壳蛋白遗传修饰;抗血管生成,

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  参考解析


 
乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界范围内呈上升趋势,严重威胁女性的身心健康。目前对乳腺癌的治疗方法主要有外科手术切除、放疗和化疗等,但是这些方法对复发和远处转移的乳腺癌治疗效果不佳。作为一种新的肿瘤治疗手段,基因治疗已被用于乳腺癌的实验治疗研究,并取得了初步效果。随着基因治疗技术的进一步发展,生物靶向治疗已成为该领域的研究热点之一,其优点是可以在最大程度上杀伤肿瘤细胞的同时减少对正常细胞的损伤,有望开创乳腺癌基因治疗的新领域。
 
腺病毒载体因其具有容量大、滴度高和不整合到宿主染色体中等优点,目前被广泛应用于肿瘤基因治疗,其中人腺病毒5型(human adenovirus type 5,hAd5)是目前基因治疗中最常用的病毒载体之一。Ad5通过其衣壳蛋白中纤维蛋白(fiber)的结节区(knob)与细胞表面的柯萨奇-腺病毒受体Coxsackie and AdenovirusReceptor,CAR)结合,然后衣壳蛋白中的五邻基(penton-base)与整合素相互作用,通过内吞作用进入细胞。但是很多肿瘤细胞中CAR的表达水平较低,影响了腺病毒的感染效率,进而降低了以腺病毒为载体的肿瘤基因治疗效果。因此,如何提高腺病毒对CAR低表达肿瘤细胞的感染效率成为腺病毒介导的肿瘤基因治疗的关键。用对肿瘤细胞具有高亲和性的多肽对腺病毒的衣壳蛋白进行遗传修饰是一种提高腺病毒感染效率的非常有效的方法,这种多肽可以通过与其自身特异的受体识别并结合来介导腺病毒对靶细胞的感染过程。这种感染过程不依赖于CAR受体介导的天然途径,如采用RGD(Arg-Gly-Asp)序列对Ad5纤维HI环进行遗传学修饰或采用多聚赖氨酸pk7(poly-lysine)对Ad5纤维结节区C末端进行遗传学修饰的腺病毒载体。并且随着对腺病毒遗传修饰的深入研究,五邻体蛋白(penton-base)、六邻体蛋白(hexon)、pIX和pIIIa等衣壳蛋白也都成为插入外源小肽的靶蛋白。
 
NGR(Asn-Gly-Arg)是通过噬菌体展示技术筛选出来的能够和肿瘤新生血管特异性结合的多肽序列,其受体是高表达于肿瘤新生血管内皮细胞的氨基肽酶N(aminopeptidaseN,APN/ CD13)。以往研究表明正常血管内皮细胞上的CD13表达未被激活,但是在肿瘤微环境中,血管生成信号可以引起血管内皮细胞上CD13的高表达。研究发现NGR多肽可以将多种肿瘤治疗药物和病毒载体靶向运输到肿瘤新生血管处,如阿霉素(DOX)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)以及病毒载体等。本课题中用NGR肽段对腺病毒进行遗传修饰,研究该病毒对CAR受体低表达的人乳腺癌肿瘤细胞MDA-MB-231的感染效率及其对肿瘤新生血管的靶向能力。
 
肿瘤的生长和转移依赖于血管增生,这些新生血管可以为肿瘤细胞的恶性生长提供充足的营养物质。肿瘤一旦建立起新生血管网,即可快速生长,转移潜能也迅速出现。因此通过抑制血管生成来抑制肿瘤的生长和转移正成为近年肿瘤治疗的一个有效的策略,目前已有多种肿瘤血管抑制因子被用于肿瘤的治疗。Arresten是Colorado等发现的一种强效的血管生成抑制因子,是Ⅳ型胶原α1链的羧基端NC1结构多肽片段,相对分子质量为26KD。Arresten是一种内源性血管生成抑制因子,能抑制内皮细胞的增殖和迁移,诱导内皮细胞凋亡,阻止血管管腔的形成。本课题中构建了经NGR肽段修饰的并表达Arresten的腺病毒,研究该病毒对人乳腺癌的治疗效果。
 
为了研究经NGR肽段修饰的表达治疗基因Arresten的腺病毒对人乳腺癌的治疗效果,本课题进行了以下三个方面的研究:
 
(1)经NGR肽段遗传修饰的携带三种报告基因mCherry,luciferase和eGFP的复制缺陷型腺病毒载体的构建及体内、体外实验检测。
 
(2)经NGR肽段遗传修饰的携带治疗基因Arresten的复制缺陷型腺病毒载体的构建及治疗基因Arresten的体外检测。
 
(3)经NGR肽段遗传修饰的携带治疗基因Arresten的腺病毒体内抗肿瘤效果研究。
 
本研究主要的实验方法和结果如下:
 
(1)knob区经NGR肽段修饰的穿梭载体的构建:设计并合成NGR肽段对应的基因片段,将其连入腺病毒knob区的穿梭载体中,经酶切和测序鉴定后获得阳性克隆pAd5/knob-NGR- shuttle。
 
(2)携带报告基因luciferase(luc)和eGFP的腺病毒E3区穿梭载体的构建:经PCR扩增获得报告基因eGFP的基因片段,酶切和测序鉴定正确后连入中间载体中T2A片段的下游;将本实验室构建保存的报告基因luc片段连入中间载体中T2A-eGFP片段的上游,经酶切鉴定获得报告基因luc-T2A-eGFP;将该基因片段连入腺病毒E3区的穿梭载体中,经酶切鉴定后获得阳性克隆pAd5CMV/E3-luc-T2A-eGFP-shuttle。
 
(3)经NGR肽段修饰的携带三种报告基因的腺病毒载体的构建及病毒制备:首先将腺病毒骨架载体Ad5用SwaⅠ酶切线性化后与经PacⅠ线性化的穿梭载体pAd5CMV/E3-luc- T2A-eGFP-shuttle在大肠杆菌Bj5183中同源重组,经酶切鉴定后获得阳性克隆pAd5CMV/ E3-luc-T2A-eGFP;将该质粒载体用SwaⅠ线性化后与经XhoⅠ线性化的穿梭载体pAd5/knob- NGR-shuttle在大肠杆菌Bj5183中同源重组,经酶切和测序鉴定后获得阳性克隆pAd5CMV/E3- luc-T2A-eGFP/knob-NGR;将该质粒载体和携带报告基因mCherry的腺病毒E1区穿梭载体pAd5CMV/E1-mCherry-shuttle用PacⅠ线性化后共转染HEK293细胞,经同源重组后获得病毒Ad5CMV/E1-mCherry/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR,经扩增和纯化后得到高滴度的病毒原液。
 
(4)经NGR肽段修饰的携带治疗基因Arresten的腺病毒载体构建及病毒制备:将腺病毒载体pAd5CMV/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR和携带治疗基因Arresten的腺病毒E1区穿梭载体pAd5CMV/E1-Arresten-shuttle用PacⅠ线性化后共转染HEK293细胞,经同源重组后获得病毒Ad5CMV/E1-Arresten/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR,经扩增和纯化后得到高滴度的病毒原液。
 
(5)腺病毒Ad5CMV/E1-mCherry/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR体内外实验检测:将该病毒感染人肺癌细胞系A549,体外检测到三种报告基因mCherry,luciferase和eGFP可成功表达;尾静脉注射该病毒至Balb/C小鼠体内,运用活体成像系统(IVIS ImagingSystem)分别在第1d,2d,3d,7d和14d在小鼠肝脏部位检测到luciferase的表达。
 
(6)腺病毒Ad5CMV/E1-mCherry/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR肿瘤新生血管靶向性检测:在裸鼠右后肢接种U87细胞建立脑胶质瘤动物模型;待肿瘤体积达到约100mm3时尾静脉注射该病毒和对照病毒Ad5CMV/E1-luc-T2A-mCherry至Balb/C小鼠体内,48h后运用活体呈像系统在小鼠肝脏部位观察到luciferase的表达,但是在肿瘤新生血管处没有检测到luciferase的表达。
 
(7)腺病毒Ad5CMV/E1-mCherry/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR体外感染肿瘤细胞效率检测:Ad5CMV/E1-mCherry/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR及未经修饰的腺病毒Ad5CMVeGFP在体外感染人肺癌细胞系A549和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,通过计算eGFP阳性细胞数发现,经NGR肽段修饰的腺病毒对MDA-MB-231细胞的感染效率明显高于对照病毒。
 
(8)腺病毒Ad5CMV/E1-Arresten/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR体外活性检测:通过RT-PCR在mRNA水平检测到治疗基因Arresten的表达;同时通过Western blot 在蛋白质水平检测到治疗基因Arresten的表达。
 
(9)腺病毒Ad5CMV/E1-Arresten/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR体内肿瘤治疗实验研究:在裸鼠右后肢接种MDA-MB-231细胞建立人乳腺癌动物模型;待肿瘤体积达到约50mm3后随机分组,于肿瘤内注射不同腺病毒进行治疗,测量肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。结果显示经NGR肽段修饰的表达治疗基因Arresten的腺病毒对肿瘤生长抑制作用最为明显。治疗26d后处死裸鼠取肿瘤组织进行病理学检测,CD31染色结果显示经NGR修饰的表达Arresten腺病毒组的微血管密度明显少于其它两组。
 
综上所述,本实验成功构建并获得了经NGR肽段修饰的携带三种报告基因的腺病毒载体pAd5CMV/E1-mCherry/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR和经NGR修饰的携带治疗基因Arresten的腺病毒载体pAd5CMV/E1-Arresten/E3-luc-T2A-eGFP/knob-NGR;经NGR肽段修饰的腺病毒对肿瘤细胞MDA-MB-231的感染效率明显高于未经修饰的对照病毒;经NGR修饰的表达治疗基因Arresten的腺病毒对乳腺癌生长抑制作用明显高于未经修饰的腺病毒。上述研究结果为该病毒对乳腺癌的临床实验治疗研究奠定了基础。
 

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