题目：拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白I亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究

拟黑多刺蚁（Polyrhachis vicina Roger）是一种重要的经济昆虫，在分类学上隶属于节肢动物门、昆虫纲、膜翅目、胡蜂总科、蚁科、多刺蚁属。其个体发育过程中经历胚胎期、幼虫期、蛹期、成虫期等各个阶段，且是一种社会性昆虫，群体内存在严格的品级分化。拟黑多刺蚁资源较易获得，实验室养殖较为方便，因此是一种独特的进行个体发育及分化研究的实验材料。
本研究以拟黑多刺蚁为实验材料，通过RT-PCR、分子克隆、生物信息学分析、荧光实时定量RT-PCR等技术首次对与其肌肉发育及肌肉生理机能相关的肌细胞增强因子2（Mef2）基因和肌钙蛋白I亚基（TnI）基因分别进行了相关研究。主要获得了以下研究结果：
1通过实验获得了拟黑多刺蚁Mef2基因两种剪接体cDNA序列，其长度分别为2074bp和1793bp，主要在5’末端存在一定差异。通过ORF搜索发现，其编码区长度为1419bp，编码472氨基酸残基蛋白，且两种剪接体具有相同的ORF。将两种剪接体cDNA序列上传至美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库，获得登陆号分别为GQ386849 和 GQ386850。
2 对预测的PvMEF2蛋白进行同源性和系统进化分析，发现其N末端具高度保守的MADS和MEF2 结构域，保守区域与其它昆虫相关序列一致性可达100%。构建的系统进化树中，膜翅目昆虫拟黑多刺蚁与意大利蜜蜂（Apis mellifera）和金小蜂（Nasonia vitripennis）聚为一支，进一步反映了各类群之间的进化关系。
3 PvMEF2蛋白的理论等电点和分子量分别是6.83和50191.5Da，其分子式为C2168H3392N628O714S16，原子总数为6918。对其翻译后修饰分析发现，共有40个可能O型糖基化修饰位点和2个可能N型糖基化修饰位点；磷酸化修饰位点分别包括丝氨酸的磷酸化位点30个，苏氨酸6个，酪氨酸6个；目前为止还未发现其信号肽序列；该蛋白无跨膜区，为非跨膜蛋白。
4 蛋白结构预测结果表明，PvMEF2 N末端存在螺旋、折叠和无规则卷曲等多种形式，这可能与MEF2通过N末端的结构形式与其它蛋白结合而发挥一定生理功能有关。
5 相对实时定量分析结果表明，在不同的发育阶段虫体及成虫不同品级中，PvMef2基因均有表达，说明其在拟黑多刺蚁发育过程中持续具有调控作用。但其表达量有一定差异。在幼虫期，一龄幼虫中表达量最高，接下来的几期幼虫呈下降趋势，而至蛹期时，其表达量又略有上升。成虫中Mef2在雄蚁中的表达量要高于其它两个品级的。不同的表达量可能影响到对不同肌肉发生相关基因的调控，从而影响肌肉发生。两种剪接体均有表达，但其表达量有一定的差别，不同剪接体在肌肉发生中的具体调控作用有待于进一步研究。
6 获得两条长度分别为1224bp和799bp的拟黑多刺蚁TnI基因不同剪接体cDNA序列。两条序列在3’末端存在一定差异，其开放阅读框分别为660bp和615bp，分别编码219氨基酸和204氨基酸蛋白。将序列分别上传至美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库，获得登陆号分别为HM484304 和 HQ230044。
7 获得的TNI蛋白序列均与意大利蜜蜂（Apis mellifera）等昆虫同源序列具有较高的一致性。系统进化树中膜翅目昆虫拟黑多刺蚁与意大利蜜蜂聚在一起，再与其它昆虫聚为一类，各分支反映了不同类群之间的亲缘关系与进化关系，但不能明确说明各蛋白亚型之间的关系。
8 TNI两种蛋白亚型理化性质接近，并与意大利蜜蜂的相似。其翻译后修饰可能位点较少，仅分别具有1个O型糖基化修饰及11个磷酸化位点。分析发现该蛋白无跨膜区，为非跨膜蛋白。
9 TNI两种蛋白亚型二级结构主要包括了螺旋和无规则卷曲等区域，而没有明显的折叠区。其三级结构具明显的3个螺旋区。
10 实时定量分析表明，TnI基因在拟黑多刺蚁各个发育阶段均有表达，但不同阶段的表达量有一定差别，可能与各个时期的肌肉结构及生理机能特点有关。不同亚型TNI在各个阶段的存在情况及功能仍需进一步的研究。
相关基因研究表明，在拟黑多刺蚁不同发育阶段及不同品级中，其肌肉分化与肌肉功能的调控与Mef2基因及TnI基因存在一定关系，为研究昆虫肌肉发生及肌肉机能提供了理论基础。但其具体调控机制及基因的确切功能有待于进一步研究。