题目：固定化酶反应器的制备及其在高效液相色谱在线筛选酶抑制剂中的应用

酶的固定化是指通过适当方法将游离酶固定到不溶性载体上的过程。固定化过程的关键是通过固定化载体的设计、制备以及固定化方法的选择，达到高负载量、高活力以及重复使用的目的。基于此，本论文以血管紧张素转移酶为目标分子，设计和制备出一系列具有高活性、多位点的功能载体材料，采用共价键合方式制备固定化酶。按照设计将固定化酶粉体填充成柱，制备成具有一定酶活力和容量的固定化酶微型反应器，进一步将该反应器与高效液相色谱连用，建立高血压药物的在线筛选系统。本论文包括四个部分 1. 绪论主要包括固定化酶研究背景、固定化方法、功能化载体制备以及固定化酶反应器模型四部分内容。重点阐述各种功能载体制备、各种固定化方法以及固定化酶反应器模型。 2. 磁性Fe3O4/壳聚糖复合微球的制备和固定化酶研究选用具有核壳结构的壳聚糖包覆Fe3O4的微球作为固定化载体。为提高酶的键合量，分别对壳聚糖层多羟基进行羟丙基化和氨基化修饰，得到外壳层含有多氨基的功能载体，并通过FT-IR、TEM、EDS、XRD等各种手段予以表征和验证。其次，酶键合过程采用EDS/NHS活化和戊二醛交联两种方式，在200 μl EDS/NHS（1 : 1 / v : v）及其2.5%戊二醛浓度条件下，酶负载量达到78.2%比文献报道高出30%。最后考察固定化酶活力、存贮性以及动力学等一系列参数。结果显示固定化酶具有良好的储存性，活力在30天后仍保持在70%以上。同时，固定化酶Km和Vmax分别为46.67和416.7，固定化酶Vmax/Km为8.9小于游离酶的14.5。 3. 三种功能载体制备、比较以及产物分子印记聚合物研究为解决键合量与活力之间的矛盾。本实验依次制备了氨基型、羧基型、氨基酸型等功能性载体，具体为氨基化修饰的磁性微粒、氨基酸化修饰的磁性微粒以及羧基化修饰的碳纳米管，通过FT-IR、XRD、TEM、EDS、Raman、激光粒度等手段予以结构表征。对上述三种载体进行固载酶实验，通过测定和对比酶负载量及活力，筛选出具有双重效能的羧基型碳纳米管作为载体。此载体在最佳条件下负载量和相对活力分别达到了68.2%和80.7%。同时，为解决体系固定化酶量小、信噪比低、反应器重复使用等问题，实验对产物马尿酸进行分子印迹富集处理。制备出酶促反应和产物富集两者并行的反应器。最终确定200 mg印迹聚合物吸附量为0.39 μM，淋洗液的洗脱体积为3.5 mL，富集柱RSD值为1.0%等参数。 4．固定化酶反应器联用高效液相色谱在线分析将固定化酶反应器与高效液相色谱联用，建立高血压药物在线筛选系统。在最佳色谱条件下，以卡托普利为抑制模型，没有产物富集处理时，得到抑制率R值为60%，RSD = 13%(n = 7)；同样条件下，在酶反应器后加入产物富集柱时，求的R = 62%，RSD = 4.7%(n = 7)，IC50 = 2.1 × 10-8 M，在文献报道范围内。相比之下，产物富集柱对酶反应器有保护和缓冲以致延长酶反应柱使用寿命的作用。