题目：槲皮素对人红细胞的双重作用的研究

生物类黄酮和天然多酚类化合物是最大的植物代谢物种类之一，迄今已经发现4000多种此类化合物存在于不同植物中。这类化合物一般具有多酚结构，因而具有抗氧化活性，被证实对人体健康具有多方面的有益作用。然而，由于天然多酚类化合物在分解代谢的过程中可能涉及自由基中间体，能够诱导活性氧生成，直接或者间接产生促氧化作用，对生物组织和生命体造成损害。因此，天然多酚类化合物具有双重作用，既有抗氧化作用，也有促氧化作用。槲皮素是这类化合物的典型代表之一。本文利用人红细胞作为实验模型，研究了在无外加胁迫时和在淀粉样多肽Aβ25-35 (Aβ25-35) 存在时槲皮素与红细胞的相互作用。实验结果表明，在无外加胁迫时，浓度大于25 μg/mL槲皮素对红细胞有促氧化作用，促氧化作用主要表现为诱导红细胞形变、减少细胞谷胱甘肽 (GSH) 含量水平、导致膜骨架蛋白聚集等，其作用与浓度和反应时间呈正相关。槲皮素对红细胞膜的促氧化作用与对苯醌的作用相似，说明槲皮素的生物促氧化可能与醌式自由基中间体有关。在另一方面，当在有外加胁迫如Aβ25-35存在时，低浓度的槲皮素对Aβ25-35产生的细胞毒性有抑制作用，这种作用与槲皮素的抗氧化及抗自由基作用有关，即具有抗氧化活性。本文在对槲皮素的双重作用进行研究的同时，建立了利用导数光谱法分析细胞膜基质游离巯基含量和高效液相色谱 (HPLC) 分析细胞膜磷脂的定量分析方法。实验的主要方法和结论：一、槲皮素与红细胞的相互作用 1. 槲皮素对红细胞膜蛋白谱带的影响提取的红细胞膜蛋白与槲皮素相互作用，用SDS-PAGE (凝胶电泳) 检测红细胞膜蛋白谱带，发现槲皮素能够诱导红细胞膜骨架蛋白聚集，抗坏血酸、EDTA及巯基还原剂DTT能够抑制细胞膜骨架蛋白聚集。说明槲皮素的促氧化作用是通过诱导产生自由基而实现的。槲皮素的促氧化活性具有浓度依赖性，在20-500 μg/mL的浓度范围内，槲皮素的生物促氧化作用与其浓度呈正相关。比较而言，较高浓度的天然多酚化合物更容易发生生物促氧化作用。 2. 槲皮素对红细胞GSH的影响 GSH的主要生理作用是作为体内一种重要的抗氧化剂，能够清除生物体内的自由基，是提供体内还原环境的重要物质之一，能够使蛋白质和酶等生物大分子在自由基等存在的氧化胁迫环境下，维持正确的结构，行使正常的生物功能。因而生物组织中GSH含量的多少能间接反映氧化胁迫情况。本实验采用Ellman方法测定红细胞GSH含量变化。由于槲皮素在测试波长范围具有较强的光吸收，因而建立了利用导数光谱测定GSH的定量分析方法，试验发现，Ellman试剂与GSH的反应产物的二阶导数光谱具有特征性，可扣除槲皮素对GSH定量分析的干扰。结果表明，槲皮素可使红细胞的GSH含量降低，其原因是槲皮素的促氧化作用消耗了还原型谷胱甘肽。 3. 槲皮素对红细胞的形态影响用槲皮素处理红细胞，显微镜下观察，可见低浓度的槲皮素处理过的红细胞少量发生形变，边缘出现棘突；高浓度槲皮素的作用下，大量细胞发生形变，边缘出现棘突，同时细胞发生大规模聚集，一些还原剂可以抑制槲皮素的这种作用。所以，槲皮素诱导红细胞变形性下降以及红细胞膜结构改变与其促氧化作用有关。 4. 槲皮素的诱导溶血作用槲皮素处理过的红细胞出现溶血现象，且与槲皮素浓度呈正相关。说明槲皮素对红细胞的促氧化作用，可以使细胞膜发生损害，变形性降低，从而导致细胞破裂。 5. 槲皮素对红细胞膜脂质的影响膜磷脂的结构和组成的变化反映了细胞膜的结构和功能的改变。分离的红细胞膜在经槲皮素处理后，采用正相HPLC分析膜磷脂成分，发现三种主要的磷脂 (PC，PE和PS) 信号降低， 反映出膜磷脂分子中不饱和双键即不饱和脂肪酸的含量减少，这是由于槲皮素促氧化产生的自由基与其发生氧化反应，导致红细胞膜磷脂脂肪酸氧化所致。PE，PC和PS含量随着槲皮素浓度的增加而减少。二、Aβ25-35存在下槲皮素对红细胞的作用 1. 槲皮素对Aβ25-35所致的红细胞膜损伤的影响 Aβ25-35是一种具有较强生物毒性的短肽，能够导致红细胞变形、聚集和溶血。低浓度槲皮素 (5-20 μg/mL) 可使Aβ25-35所致的红细胞损伤得到一定减缓。所以，当有外加胁迫Aβ25-35存在时，低浓度槲皮素表现出对细胞具有保护作用；但当加大槲皮素浓度之后，发现槲皮素对Aβ25-35所致的红细胞损伤不但无缓解作用，反而加剧溶血，说明较高浓度槲皮素的作用为促氧化。 2. 槲皮素在Aβ25-35存在下对红细胞形态的影响红细胞经过Aβ25-35处理后，通过扫描电镜观察可见红细胞发生了轻度聚集且发生破裂，周围有丝状物质，这些丝状物质是红细胞在Aβ25-35作用下膜破损后内容物溢出所致。加入槲皮素之后，细胞形态没有得到改善，细胞边缘开始出现棘突。所以，在Aβ25-35存在下，槲皮素对红细胞的形变具有促进作用。综上所述：较高浓度的槲皮素对红细胞具有促氧化作用，这种促氧化作用主要体现在导致膜骨架蛋白聚集、降低细胞谷胱甘肽水平、改变细胞膜磷脂的组成和含量以及诱导细胞产生形变和聚集等等，其作用大小与浓度和反应时间呈正相关。在有外加胁迫Aβ25-35存在时，槲皮素可降低Aβ25-35对细胞的损害作用。这些结果表明，槲皮素的生物效应具有双重性。