题目：鸡蛋清溶菌酶在淀粉样纤维化过程中的结构变化及其细胞毒性机理

目前有超过20种的人类疾病都与天然多肽转变为富含β折叠的淀粉样纤维有关，如老年痴呆症（Alzheimer’s）、帕金森疾病以及二型糖尿病等等，我们把这些疾病定义为淀粉样变性(amyloidosis )疾病。这些疾病是由正常的可溶于血浆的蛋白转变为不溶的淀粉样纤维形态沉积于细胞外造成的，我们把这些纤维样聚集定义为淀粉样纤维(amyloid fibril)。它们几乎可以对所有的器官产生影响，因此具有一定的系统性，这也是临床诊断和治疗面临的一个主要挑战。迄今为止已发现至少有36种蛋白能发生淀粉样变性形成淀粉样沉积，造成心血管系统、神经系统以及泌尿系统损害，引发各种疾病。
从理论上来说，所有的蛋白质或多肽在一定的条件下，都可以自我组装形成淀粉样纤维。实验研究发现，许多蛋白包括一些非致病性的蛋白质和短肽都可以形成纤维。目前研究较多的有溶菌酶、Aβ肽、胰岛素、朊蛋白（prion）、核突触蛋白（synuclein）和微球蛋白等。淀粉样纤维的形成是一个复杂的过程，会产生一系列不同大小和形态的中间体，最后形成包括寡聚体（oligomers）、原纤维（protofilaments）等中间体和成熟纤维（mature fibrils）的淀粉样纤维混合物。它们通过聚集在器官或组织上形成淀粉样沉积，导致器官或组织的去功能化，从而导致相关病症的发生。目前对淀粉样蛋白的纤维化过程、淀粉样纤维的有毒成分及其毒性机理进行了很多研究，但是其确切机制仍然不清楚，仍然存在很多的问题和挑战，特别是在分子水平和蛋白结构方面，因此进一步进行研究是十分必要的。
本文中选用鸡蛋清溶菌酶作为淀粉样蛋白，以人类红细胞作为体外实验的细胞模型，研究了鸡蛋清溶菌酶淀粉样纤维化过程中的结构变化、细胞毒性的变化，淀粉样纤维混合物中各组分的细胞毒性的大小，并对溶菌酶淀粉样纤维造成红细胞损伤的毒性机理进行了研究，以寻找淀粉样纤维诱导细胞毒性的分子途径，为淀粉样疾病的治疗提供理论和实验依据。
主要方法与结论：
1.? 溶菌酶纤维生长的检测
采用了蛋白荧光标记技术（包括ThT荧光标记，ANS荧光标记）以及圆二色谱技术来检测溶菌酶纤维的生长动力学。结果表明，溶菌酶纤维在生长过程中，蛋白α螺旋减少, β折叠结构逐渐增多，内部的疏水区域也渐渐外露。
2. 溶菌酶纤维形态的检测
通过刚果红染色后偏光显微镜观察和透射电子显微镜对淀粉样纤维进行观测。结果表明，孵育成熟的溶菌酶纤维在偏光显微镜下呈现黄绿色，这是淀粉样纤维的一个典型特征。在透射电子显微镜下，成熟的溶菌酶纤维呈纤维状，并相互聚集形成淀粉样沉积，淀粉样沉积是淀粉样疾病的一个主要表征。溶菌酶纤维的小分子SDS-PAGE说明了溶菌酶纤维的孵育制备过程中有少量淀粉样纤维聚集体的产生和部分酸水解产物的存在。
3. ?溶菌酶纤维的细胞毒性研究
溶菌酶纤维与红细胞共同孵育后，通过光吸收检测上清中血红蛋白的量。结果表明，随着纤维孵育时间的增加，其细胞毒性也增加，从第4天开始达到一个平台期。结合高速离心和超速离心，对成熟纤维的各组分进行了分离，并进行了蛋白含量测定和细胞毒性检测。结果表明，低聚物(寡聚体和原纤维)约占成熟淀粉样纤维混合物的一半，可溶性的低聚物在纤维组分中具有较高的细胞毒性。
4. ?溶菌酶纤维的细胞毒性机理研究
溶菌酶纤维与红细胞膜共同孵育后，用SDS-PAGE进行分离，结果显示在上样孔和高分子量区域出现了明显的大分子聚集，同时细胞膜蛋白的各个条带变浅，这些大分子是由溶菌酶纤维与膜蛋白共同形成的。接着对蛋白电泳的浓缩胶部分（含上样孔）和高分子量区域进行了Western Blotting免疫印迹检测。其结果清楚地显示了溶菌酶纤维参与了大分子聚集物的形成，这些大分子聚集物主要集中在上样孔和浓缩胶部分。合并质谱解析结果，我们得出结论，溶菌酶淀粉样纤维与膜蛋白通过二硫键交联形成了大分子的聚集物，这些大分子聚集物沉积于红细胞膜上，从而对红细胞造成损伤，引起红细胞的破裂。这表明了二硫键在溶菌酶纤维的细胞毒性中起着关键的作用。
5. 溶菌酶纤维化过程中二硫键的外露情况
在本研究中，对天然溶菌酶分子及其淀粉样纤维的表面二硫键进行测定，（1）通过mBBr荧光标记技术进行荧光检测；（2）用DTT把外露的二硫键还原成自由巯基，然后用NEM对自由的巯基进行共价封闭，结合ESI-MS/MS质谱分析二硫键的外露情况。结果表明溶菌酶纤维在孵育过程中的确伴有分子内二硫键的外露，通过质谱分析得出了溶菌酶中8个半胱氨酸外露的难易程度。这些结果进一步证实了二硫键在溶菌酶纤维的细胞毒性中的主导作用。