题目：超声激活原卟啉IX诱导小鼠白血病L1210细胞凋亡研究

??? 声动力学疗法(Sonodynamic therapy, SDT )是1989年Umemura S等人在研究超声结合血卟啉抗肿瘤效应基础上提出的一种肿瘤治疗方法。由于超声能够穿透深层组织，并能激活特异性富集在肿瘤组织中的声敏剂分子，有针对性地杀伤肿瘤细胞而对周围正常组织损伤较小，因此，该疗法具有良好的应用前景。近年来，本课题组在对SDT研究中发现，低强度超声激活血卟啉、原卟啉Ⅸ等能够诱导肿瘤细胞凋亡，并且原卟啉Ⅸ (Protoporphyrin Ⅸ，PpⅨ) 作为血卟啉衍生物的一种有效成分，其结合超声诱导肿瘤细胞凋亡能够产生比血卟啉更强的作用。然而，不同肿瘤细胞经不同的超声参数及声敏剂处理后，其凋亡特征亦有差异，超声激活PpⅨ诱导肿瘤细胞凋亡的具体作用机制尚不清楚。
??? 本论文以国家自然科学基金项目“超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制的研究”和“声动力学疗法介导白血病细胞的死亡模式及其机制研究”为依托，采用频率为1.1 MHz的聚焦超声结合浓度为1 μg/ml的PpⅨ作用于离体培养的L1210小鼠白血病细胞，通过研究声动力学处理后细胞内与凋亡相关的生理生化指标的变化及相关蛋白的表达变化，初步探讨声动力学疗法诱导肿瘤细胞凋亡的分子机理，目前取得的实验结果如下：
????? 1. MTT法检测细胞存活率发现，超声结合PpⅨ处理L1210小鼠白血病细胞较单纯PpⅨ组、单纯超声组能够显著抑制细胞增殖，并且随处理后时间的延长，细胞存活率进一步下降，于处理后8 h降至最低水平（36.34 %）。
????? 2. Western blotting检测Caspase-3的表达发现，SDT组和单纯超声组出现明显的Caspase-3剪切片段，而对照组和单纯PpⅨ组均未出现Caspase-3活化片段。并且SDT组Caspase-3剪切片段的表达量较单纯超声组高；通过流式细胞仪结合Annexin V/7-AAD荧光双染检测各组凋亡细胞百分比发现，SDT组凋亡细胞百分比明显高于单纯超声组。结果表明，单纯PpⅨ无诱导L1210细胞凋亡作用，而单纯超声和SDT能诱导L1210小鼠白血病细胞凋亡，且后者比前者作用更明显。
????? 3. 通过激光共聚焦扫描显微镜观察PpⅨ在L1210小鼠白血病细胞中的定位，结果显示PpⅨ和线粒体特异性标记探针MitoTracker Green有明显共定位，表明PpⅨ在L1210细胞中主要定位于线粒体，提示线粒体可能在超声结合PpⅨ诱导L1210小鼠白血病细胞凋亡中起重要作用。
????? 4. 流式细胞仪检测发现，SDT处理后L1210小鼠白血病细胞内产生了大量活性氧，线粒体膜电位明显下降，DNA片段化程度升高。提示声动力处理促使的细胞内活性氧产生，线粒体膜电位下降，DNA损伤等可能是引发L1210细胞凋亡的重要原因。
????? 5. 通过免疫荧光、western blotting、流式细胞仪等方法检测SDT处理后L1210细胞内相关蛋白的亚细胞定位及含量变化，发现凋亡相关蛋白Bax转定位至线粒体，细胞色素C释放至胞浆，Caspase-9被剪切活化且Caspase-9活化片段的表达有所升高，Bcl-2的表达量明显下调，提示超声结合原卟啉Ⅸ诱导L1210小鼠白血病细胞凋亡可能依赖于线粒体凋亡通路。