题目：小鼠和牛腔前卵泡体外分离培养的研究

哺乳动物卵巢含有大量处于不同发育阶段的卵母细胞,其中多数卵母细胞存在于无腔阶段的卵泡中，但大部分卵泡在无腔阶段（腔前卵泡）中闭锁、退化，没有得到相应的利用,这无疑是动物遗传和育种资源的极大浪费。因此，腔前卵泡的开发无疑是解决这一难题的有效途径。腔前卵泡的体外培养技术已取得了一定的发展，建立了多种培养体系,有其各自的优缺点, 研究者一直在摸索合适的培养模型，以期找到一种能够模拟体内卵泡发育的环境条件和模式。影响腔前卵泡体外培养的因素很多，总结以前的成功经验，本研究从其中几个方面进行研究，旨在摸索出一套适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的分离培养体系。
1. 通过石蜡切片-HE染色技术，研究不同发育时期小鼠卵巢内卵泡的分布状况及发育规律，选择适合发育时期的小鼠，为高效地将腔前卵泡分离出来奠定基础，还可为体外培养过程中卵泡发育结果鉴定的提供参考。研究结果显示：随着小鼠的发育，卵巢发育由最初的无皮质髓质之分到皮质髓质明显可分，卵泡发育从只能看见聚集呈条索状到发育成原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡，直至有腔卵泡的形成。从数量上看，原始卵泡逐渐减少，初次级卵泡逐渐增多，有腔卵泡数量也从无到有从少到多。卵巢由最初的无卵泡发育到有许多大小不等、处于不同发育时期的卵泡、大部分有腔样结构。生后10天~15天的小鼠的腔前卵泡最多，且此时的卵巢结缔组织、脂肪组织等都比较少，易于分离得到数量多且结构完整的腔前卵泡。另外，各级卵泡的分布在卵巢中具有区域性，卵巢皮质的最外层分布有大量的原始卵泡，密度较高，初级卵泡次之，次级卵泡则多数位于最内层，在皮髓的交界处分布相对较多。三级卵泡和成熟卵泡会突出于表皮。从本实验研究结果来看，选择生后15天左右的小鼠的卵巢作为本研究体外分离腔前卵泡的材料比较理想。
2. 通过腔前卵泡的分离时间、数量、正常率、回收率等评价标准来比较酶-机械结合法和显微分离法这两种分离方法，旨在找出一种适合于从生后15天小鼠卵巢中分离腔前卵泡的有效分离方法，为更好地进行小鼠腔前卵泡的体外培养做好关键的第一步。研究结果显示：酶-机械分离法回收得到腔前卵泡的数量明显多于单纯的机械分离方法（显微分离法），且选择胶原酶浓度为0.1%分离的数量更多且正常卵泡数多。显微分离法所需时间较长，数量少，但体外培养6天后卵泡存活率更高。综合考虑，本实验选择采用显微分离方法分离生后15天小鼠腔前卵泡用做体外培养。
3．通过建立一个适于小鼠腔前卵泡体外发育无血清培养系统，探索添加FSH、LH、VC对小鼠卵泡/卵母细胞体外生长发育的影响，旨在摸索一套适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的培养体系。结果表明：腔前卵泡随着体外培养时间的延长，卵泡越来越大，卵泡直径和其中的卵母细胞直径都增加，但是卵母细胞增长的没有卵泡增长的快。且各浓度组在培养的第4天时，卵泡及卵母细胞直径增长最快。且第4天与第2，6，8天的卵泡增长值存在显著性差异（P）。无血清基础培养液中联合添加FSH400+LH 200、VC50ug/ml能够较大程度的促进卵泡及其中的卵母细胞增长，提高卵泡的存活率及成腔率，第八天后添加hCG和EGF进行培养24h，发生的GVBD率和排出PB1率比对照组要高。
4. 运用DNA琼脂糖凝胶电泳技术和RT-PCR技术来分别检测上述所选的无血清培养系统培养的不同时间的腔前卵泡凋亡情况及其Bcl-2/Bax 在mRNA层次的基因表达情况，从分子生物学方面对该无血清培养系统进行评价。结果表明：在卵泡培养的第0天和第2，第6天，无论基础培养液还是上述的联合添加的完全培养液，bax 和bcl-2基因都有表达，且随着培养时间的延长其表达越来越强，但是在培养的初中期 bax的表达与bcl-2相当。只是在第6天时，对照组中表达稍强些。从培养的效果来看，实验组与对照组在培养的同期相比，实验组的Bax、Bcl-2基因表达均比对照组要强。DNA琼脂糖凝胶电泳检测卵泡凋亡结果显示：不论对照组还是实验组，都没出现典型的细胞凋亡的特征。表明本实验采用的基础培养液中联合添加FSH400 mIU/mL 、LH 200 mIU/mL和VC50ug/ml后用于体外腔前卵泡的培养是可行的。
5. 本研究还对牛卵巢中腔前卵泡和有腔卵泡的分布和形态学特征进行了研究，同时对牛卵巢中的腔前卵泡进行了体外分离和体外成熟培养，结果表明：牛卵泡的分布具有明显的区域性,与小鼠卵巢中卵泡的分布一致。体外培养试验中得到了释放第一极体的成熟卵母细胞。