题目：CuAO及其催化产物H2O2在绿豆下胚轴不定根发生过程中的作用研究

摘?? 要
植物多胺氧化降解产物过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)参与发育过程中的细胞壁成熟和木质化以及病原体感染过程中的创伤愈合、细胞壁加厚过程。作为一种信号分子，多胺氧化降解产物H2O2介导细胞死亡、超敏反应以及防御基因表达。最近的研究表明，多胺氧化降解产物H2O2参与大豆侧根发育，铜胺氧化酶(copper amine oxidases, CuAO, EC 1.4.3.6)催化产物H2O2在ABA诱导的蚕豆气孔关闭过程中发挥了重要作用，本实验室的研究也证实CuAO及其催化产物H2O2参与光/暗调控蚕豆气孔运动，但至今尚未见CuAO及其催化产物H2O2参与不定根发生的报道。本实验以绿豆(mung bean)为材料，借助药理学分析、激光扫描共聚焦显微镜技术及酶活性分析方法，研究了CuAO及其催化产物H2O2在绿豆下胚轴不定根发生过程中的作用。本研究对于进一步了解多胺氧化降解在根发育过程中的作用以及不定根发生机理有重要理论意义。
主要实验结果如下：
1. CuAO催化腐胺(putrescine, Put)氧化降解，所试浓度CuAO专一性抑制剂氨基胍(Aminoguanidine, AG)显著抑制不定根发生，且呈明显剂量和时间依赖效应。CuAO活性降低抑制生根，表明CuAO可能参与绿豆下胚轴插条不定根发生。
2. CuAO催化Put氧化降解的主要产物是H2O2，NH3和4-氨基丁醛，4-氨基丁醛再经几步反应可生成γ-氨基丁酸(GABA)和琥珀酸(Succ)。本实验结果表明，H2O2、NH3、GABA和Succ四种催化产物中只有H2O2显著促进不定根发生，而NH3、GABA和Succ无显著促进作用。另外，四种催化产物中只有H2O2能够显著逆转AG对不定根发生的抑制效应。这些结果表明，CuAO的催化产物H2O2在绿豆下胚轴不定根发生中起作用。
3. Put为CuAO催化底物，AG抑制不定根生成的效应也可能与Put增加有关。我们的结果证实，外源Put并不影响生根，可见CuAO抑制剂抑制不定根生成与Put增加无关。
4. 利用H2O2特异荧光探针H2DCF-DA和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测插条基部0-2mm生根区域横切片内源H2O2水平及其分布的结果表明，对照和AG处理插条H2O2荧光主要分布在维管组织之间的区域及正在形成的根原基中，0-60h时间范围内上述区域H2O2荧光逐渐增强，呈现H2O2荧光的细胞逐渐增多，荧光面积逐渐扩大，且H2O2荧光的增强先于不定根的形成。与对照同期相比，AG处理H2O2荧光较弱，荧光范围较小，根原基发育相对延迟。此结果表明，AG处理的确通过引起内源H2O2含量的降低从而抑制生根，CuAO催化产物H2O2确实参与了不定根发生。
5. 本实验以组织化学原位检测法对不定根发生过程中插条基部0-2mm生根区域横切片CuAO活性水平进行了检测。当过氧化物酶存在时，H2O2与3,3-二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)结合随即原位生成稳定的红棕色聚合物，当提供足够底物Put时，对照和AG处理DAB染色的差异可间接反映出H2O2 生成酶CuAO活性的大小及变化。结果表明，对照和AG处理插条基部生根区域DAB染色所得红棕色沉淀主要分布在维管组织之间的区域及正在形成的根原基中，0-60h时间范围内上述区域红棕色沉淀强度逐渐增加，呈现红棕色染色印迹的细胞逐渐增多，面积扩大，红棕色沉淀增加先于不定根形成，这些与H2O2荧光的分布及变化一致。与对照同期相比，AG处理红棕色沉淀较少，沉淀分布范围较小，根原基发育也相对延迟。对照与处理相比，DAB染色的净增量表明CuAO活性呈现逐渐增加的趋势。此结果表明，CuAO确实参与不定根发生。
综上所述，本研究的结果表明CuAO及其催化产物H2O2确实参与绿豆幼苗下胚轴不定根发生，二胺氧化降解在不定根发生过程中起着重要作用。
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