题目：聚焦超声结合原卟啉Ⅸ对H22 肿瘤抑制作用的研究

超声是一种频率高于20 KHz 的弹性机械能量波，其具有方向性好，穿透能力强，易于聚焦等特点。目前超声已经应用于医学、军事、工业、农业等诸多领域。在超声医学领域中，超声诊断技术已经成熟应用于对各种疾病的预测与检查，另外超声在一些疾病的治疗方面也取得了一定的成果。声动力学疗法(Sonodynamic therapy, SDT)是利用超声具有准确聚焦并作用于深部组织的能力，激活能在肿瘤细胞中富集且相对无毒的声敏剂分子来杀伤肿瘤细胞，最终达到治疗癌症目的的一种新方法。声动力学疗法作为多学科、多因子抗癌新途径探索，不同的声敏剂、超声参数及所研究的生物系统模型等都可能影响其抗肿瘤的机制和疗效。自从1989 年日本学者Umemura 等首次提出声动力学疗法以来，国内外学者做了大量基础研究工作，就声动力学疗法的抗癌效应和机制做了多方面的研究，取得了一些阶段性成果。但其杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤生长的详细作用机制还需要进一步的深入研究。本论文依托国家自然科学基金项目 “超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡的分子生物学机制” (No. 30270383)和“陕西师范大学优秀博士项目”的支持，在前期研究工作的基础上，采用频率为1.43MHz 的聚焦超声结合原卟啉IX (protoporphyrin IX, PPIX) 对H22 肿瘤的抑制作用进行研究，实验结果如下：1. 原卟啉IX 的特性研究及实验参数筛选：检测出原卟啉IX 的最大激发波长为407 nm，最大发射波长为604nm，并绘制原卟啉IX 浓度-荧光强度标准曲线；利用原卟啉IX 的荧光强度定量检测其在H22 肿瘤细胞内的富集代谢过程，确定合适的超声辐照时间点为孵育后30min；通过检测肿瘤细胞在不同强度超声辐照后的存活率，确定超声处理强度范围为1～2W/cm2，处理时间为1 min；检测不同超声强度结合不同原卟啉IX 浓度处理条件下细胞的存活率，发现原卟啉IX 能显著增强超声的杀伤作用，超声结合原卟啉IX 杀伤肿瘤细胞的浓度阈值为20 μM，因此选择对H22 肿瘤细胞杀伤研究的处理参数为：超声强度1 W/cm2，原卟啉IX 终浓度20 μM，处理时间为1 min。实验结果表明在频率为1.43 MHz 条件下1 W/cm2 的超声处理1 min 可以在一定程度上降低肿瘤细胞的存活率(87.17%)，聚焦超声结合原卟啉IX 能在超声作用的基础上进一步降低肿瘤细胞的存活率(77.17%)，单独原卟啉IX 对肿瘤细胞的存活率影响不是很明显(92.76%)。2. 显微水平及超微水平形态学观察发现：单独原卟啉IX处理组细胞结构完整，与对照组比较没有明显的差别；单独超声处理组可观察到部分细胞结构变形及少量细胞碎片；而超声结合原卟啉IX组肿瘤细胞结构明显受损，部分细胞可见典型的凋亡形态，随着孵育时间的延迟，凋亡形态的细胞数量逐渐增多。透射电镜观察发现细胞膜、线粒体、内质网等膜性结构是超声结合原卟啉IX抗肿瘤的主要靶位点，通过延迟观察发现，随着处理后孵育时间的延长，II在超声直接杀伤肿瘤细胞的基础上，超声结合原卟啉IX可能存在诱导肿瘤细胞凋亡的模式。3. 肿瘤细胞内脂质过氧化水平和胞质内钙离子浓度的检测发现：原卟啉IX-声动力学疗法处理后能显著提高H22 细胞的脂质过氧化水平及胞质内钙离子的浓度。原卟啉IX-声动力学疗法能够产生自由基，造成肿瘤细胞膜脂质过氧化，直接或间接破坏细胞的膜系统，引起过多钙离子进入细胞质。由实验结果推测氧化损伤及钙离子的负载可能是超声结合原卟啉IX 引起肿瘤细胞死亡的一个上游事件。4. 建立H22 肿瘤ICR 小鼠荷瘤模型并对原卟啉IX 在荷瘤小鼠体内的代谢情况进行研究：结果发现在注射原卟啉IX 后8 到36 小时是原卟啉IX 在肿瘤组织内相对含量较高的富集时间段，此时间段内原卟啉IX 在肿瘤组织的浓度至少是血浆的24 倍、肌肉的 6 倍和皮肤的1.7倍，因此8 小时到36 小时为合适的处理时间点。本论文应用超声间隔处理三次的治疗模式 (分别在给药后8、12、24 小时处理)，以期获得最佳的抗肿瘤效应。5. 聚焦超声结合原卟啉IX 对在体H22 肿瘤的抑制作用研究：采用频率为1.43 MHz、强度为3 W/cm2 的聚焦超声结合5.0 mg/kg 原卟啉IX，分别在原卟啉IX 注射后8、12 和24 小时进行超声处理。结果发现单独原卟啉IX 对H22 肿瘤的生长抑制作用与对照组没有差异性；单独超声处理组表现出明显的肿瘤体积抑制(抑制率为30.97%)和肿瘤重量抑制(抑制率为19.92%)的效应；聚焦超声结合原卟啉IX 处理组对肿瘤生长的抑制效应更为明显(体积抑制率为53.84%；重量抑制率为45.86%)，并且处理后随着时间的延迟，与对照组肿瘤相比，超声结合原卟啉IX 组肿瘤体积相对值越来越小，肿瘤生长受到明显抑制，小鼠活动能力相对较高。6. 在体肿瘤的组织学及超微形态学观察发现：原卟啉IX 处理组肿瘤组织结构完整，与对照组比较没有明显的差异性；经三次超声处理后，肿瘤组织处理部位出现坏死团块，一些肿瘤细胞呈分散状态；肿瘤组织在超声结合原卟啉IX 处理后坏死区域明显增大，结构破坏更加明显，存在许多细胞碎片。超微结构观察发现超声结合原卟啉IX 处理后，细胞膜和核膜破坏严重，细胞内物质流失，胞质出现大的空区和团块状聚集结构，核内染色质凝集严重且有大的空区出现。7. 在体H22 肿瘤组织脂质过氧化水平及主要的抗氧化物酶活力研究发现：超声结合原卟啉IX 处理后肿瘤组织内脂质过氧化水平明显增高；超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的活力均有不同程度的下降。推测超声激活原卟啉IX 产生抗肿瘤作用是通过氧化损伤造成膜脂质过氧化，引起肿瘤组织内主要抗氧化物酶活性下降，最终产生抗肿瘤的作用。同时，通过免疫组织化学方法发现，超声结合原卟啉IX 处理后的肿瘤组织，在肿瘤组织中坏死区域周边Caspase-3 蛋白活性呈现强阳性表达，推测超声结合原卟啉IX 处理在导致肿瘤组织脂质过氧化水平加剧，促使肿瘤细胞内主要抗氧化物酶活性下降的同时，可能存在诱导凋亡的作用。本研究在前期实验的基础上，选择原卟啉IX 作为声敏剂研究声动力学疗法抑制H22 肿瘤III的生物学特性，初步研究超声结合原卟啉IX 对H22 肿瘤细胞及在体H22 肿瘤组织的杀伤和抑制作用，探讨原卟啉IX-声动力学疗法抑制肿瘤生长的生物学机制，为声动力学疗法应用于肿瘤的临床治疗积累相关资料。