题目：外源性PpIX对小鼠S180,L1210肿瘤细胞周期的影响及机制初探

摘 要
光动力学疗法（Photodynamic therapy，PDT）和声动力学疗法（Sonodynamic therapy，SDT）是近些年出现的两种抗癌新思路和新方法，它们主要是基于激光或超声和光敏剂（或称声敏剂）的协同效应，即激光或超声能够激活肿瘤组织中特异性富集并长时间滞留的光（声）敏剂，使其产生抗肿瘤因子而杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤生长。光（声）敏剂作为光动力疗法和声动力疗法中的核心成分，在光动力和声动力疗法中发挥重要的作用。基于此，国内外相关学者致力于研究和研发各种新型光（声）敏剂如各种卟啉类化合物的衍生物，抗癌药物，以进一步优化这两种疗法。到目前为止较好的声敏剂仍是以卟啉类为主。原卟啉IX(Protoporphyrin IX, PpIX)是血卟啉衍生物的一种有效组分，它作为一种较为理想的光敏剂，在PDT中被广泛研究，在SDT中，对PpIX的研究刚刚处于起始阶段。而PpIX对肿瘤细胞作用的具体机制，目前知之甚少。
本论文在实验室前期研究的基础上，以国家自然科学基金项目“超声激活血卟啉抗肿瘤细胞的分子生物学机制”和“超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制的研究”为依托，采用不同浓度外源性PpIX对离体培养的S180，L1210肿瘤细胞的损伤作用进行研究，通过PpIX对细胞周期的影响，初步探讨PpIX抑制肿瘤细胞的作用机制。目前取得的实验结果如下：
?1.???? 不同浓度PpIX对肿瘤细胞表现出不
同的生长抑制作用：当PpIX浓度小于1
μg/ml时，PpIX对S180, L1210细胞的生
长基本没有影响；PpIX浓度为1 μg/ml
时，PpIX对S180, L1210细胞的生长表现出轻微的抑制效应，但与对照组相比，差异不显著（P>0.05）；当PpIX浓度大于1 μg/ml时，PpIX在两种细胞中产生明显的生长抑制效应，并呈现浓度依赖效应，当PpIX浓度为5，10，20，40 μg/ml时，与对照组相比，差异显著（P）。另外，PpIX对S180, L1210细胞的生长抑制效应随着时间的延长表现出一定的变化规律：细胞的相对存活率在PpIX作用0-8 h逐渐降低，在8 h时降至最低，随后随着时间延长，细胞相对存活率逐渐上升。
2.???? 流式细胞仪检测不同浓度PpIX作用于S180, L1210细胞不同时间后对其细胞周期
的影响，结果显示：不同浓度PpIX作用于S180，L1210细胞12 h后，随着PpIX浓度增加，与对照组相比，S期细胞逐渐上升，当PpIX浓度为40 μg/ml时, S180细胞S期细胞比例由对照组的42.65%上升至58.21%， L1210细胞S期细胞比例由对照组的42.89%上升至55.37%，即产生S期阻滞；当不同浓度PpIX作用S180，L1210细胞24 h后，依然表现为S期阻滞，当PpIX浓度为40 μg/ml时，S180细胞S期细胞比例由对照组的31.62%上升至52.59%； L1210细胞S期细胞比例由对照组的36.87%上升至49.48%；不同浓度PpIX 作用S180，L1210细胞36 h和48 h后，随着PpIX浓度增加，各个时相的细胞所占的比例与对照组相比没有差异。流式细胞术结果表明：超过一定浓度的PpIX抑制S180, L1210细胞的生长，可能与其产生S期阻滞相关，但外源性PpIX作用S180和L1210细胞引起其周期阻滞的情况相似，无细胞差异性。
3．Western-Blot检测S180, L1210细胞中细胞周期相关分子的表达，结果显示：不同
浓度PpIX作用S180细胞12，24，36，48 h后，随着PpIX浓度增加，与对照组相比，CDK2的表达没有改变；不同浓度PpIX作用S180细胞12，36，48 h后, 随着PpIX浓度增加，与对照组相比，cyclinA的表达没有改变；不同浓度PpIX作用S180细胞24 h后, 随着PpIX浓度增加，与对照组相比，cyclinA的表达上调，p53，p21蛋白表达上调。不同浓度PpIX作用L1210细胞12，24，36 h后，随着PpIX浓度增加，与对照组相比，CDK2，cyclinA的表达没有改变；不同浓度PpIX作用L1210细胞24 h后, 随着PpIX浓度增加，与对照组相比，p53表达没有变化，p21蛋白表达略微上调。
4.在S180细胞中，重要的抑癌因子p53和p21在PpIX诱导其产生S期阻滞中发挥了一定作用，可能DNA的损伤诱导了p53的表达，进一步上调了p21，p21作为广谱的CDK抑制因子，抑制了CDK2的活性，使得DNA复制速度减缓，发生S期阻滞。在L1210细胞中，抑癌基因p53在这过程中不发挥作用，而p21的表达上升为何种方式？是否为p53非依赖性，其具体的机制需要进一步的研究。
5. RT-PCR检测S180, L1210细胞中细胞周期相关分子mRNA的表达，结果显示：不
同浓度PpIX作用S180，L1210细胞12 h后，随着PpIX浓度增加，与对照组相比，CDK2，cyclinA ，cyclinD1， cyclinE ，p53，p21的mRNA表达在这两种细胞中没有发生改变，说明PpIX浓度增加对细胞周期相关分子的基因转录过程没有影响。 PpIX作用S180细胞24 h，细胞周期相关分子mRNA的表达虽未变化，但Western结果显示p53，p21蛋白上调，可能与此时mRNA的翻译调控有关，如mRNA翻译频率上升或是mRNA稳定性增加，最终使得细胞周期相关分子蛋白表达上调。但具体的机制需要深入研究。
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