题目：非标记阵列电化学适体传感器的研究

阵列生物传感器技术作为一种高通量、快速、选择性高和集成化的分析技术，已在基因组学和蛋白质组学的研究和药物筛选、环境分析，食品分析，临床诊断等领域中得到广泛的应用。阵列生物传感器主要有阵列光学生物传感器和阵列电化学生物传感器。阵列电化学生物传感器是将生物分子识别物质如酶、抗原/抗体、DNA等固定在阵列电极上，以阵列中每根电极产生的电化学信号作为检测信号的电化学分析器件。阵列电化学生物传感器以灵敏度高、分析速度快、选择性好、易于微型化和集成化以及仪器价格低廉等特点受到了研究工作者的极大关注。
阵列电极是组装阵列电化学生物传感器的基础电极，它的制作是设计和构建阵列电化学生物传感器的基础。文献报道的阵列电化学生物传感器采用的阵列电极主要是通过制作成本昂贵、制作程序复杂的平版印刷技术结合金属沉积技术获得的，限制了阵列电极的应用范围，因此急需建立制作方法简便、成本低廉的阵列电极制作方法。传统的阵列生物传感器主要是以酶、抗原/抗体或DNA等作为生物分子识别物质，抗原/抗体制备比较繁琐、困难，酶易失活、难以长时间保存，这些缺点一定程度上限制了阵列生物传感器的发展，因此，亟需探索新型高特异性、高稳定性的生物分子识别物质，建立高选择性、高灵敏度的阵列生物传感器。利用体外筛选技术获得的适体不仅克服了传统生物识别分子的缺点，而且具有传统生物识别分子所不具备的优势，因此适合构建以适体作为分子识别物质的阵列电化学生物传感器。
本论文的研究目的是探索简便、价格低廉的阵列电极制作方法，以制作的阵列电极作为基础电极，构建具有高灵敏度、高选择性的阵列电化学适体传感器，为多组份同时检测提供一些基础性研究资料。本论文研究工作是在国家自然科学基金委“半导体集成化芯片系统基础研究”重大研究计划面上项目，“微阵列生物传感器化学放大基础研究”（编号90607016）项目的资助下完成的。本论文由五章组成。
第一章 引言。简单介绍了阵列电极和阵列电化学生物传感器的原理，详细介绍了阵列电极制作方法，着重评述了阵列电化学生物传感器研究进展；介绍了适体的特征和电化学适体传感器的发展状况；最后阐述了本论文的选题背景、研究思路、研究目的和研究内容。
第二章 碳纳米管糊填充多孔管阵列电极同时检测抗坏血酸和尿酸。以聚甲基丙烯酸甲酯七孔管作为电极支撑体，以碳纳米管作为电极材料，设计了由六个工作电极（直径0.80 mm）、一个对极（直径1.6 mm）和一个微型参比电极（尖端直径1.0 mm）组成的阵列碳纳米管糊电极。通过在翻转的阵列电极表面滴加50 μL溶液构建微滴电解池。利用组装的阵列碳纳米管糊电极和微滴池构建了一个简单、快速同时检测抗坏血酸和尿酸的伏安分析新方法。在6.0×10-5mol/L尿酸存在下，抗坏血酸的氧化峰电流与其浓度在2.0×10-6～8.0×10-4 mol/L之间呈良好的线性关系，检出限1×10?6 mol/L；在2.0×10-5 mol/L抗坏血酸存在时，尿酸的氧化峰电流与其浓度在2.0×10-6~8.0×10-4 mol/L之间呈良好的线性关系，检出限1×10?6 mol/L。阵列电极在硫酸纸上抛光即可获得全新的表面。设计和组装的阵列电极用于人尿样中抗坏血酸和尿酸的同时测定，获得了令人满意的结果。研究工作表明，检测小分子电活性物质的碳纳米管糊阵列电极具有表面易更新，灵敏度高，试剂和样品消耗小等特点。
第三章 非标记凝血酶阵列电化学适体传感器的研究。以聚乙烯不干胶掩膜母版法结合金属溅射沉积技术获得了制作方法简便、成本低廉的集成化带状阵列金膜电极，以阵列金膜电极作为基础电极，以凝血酶适体作为分子识别物质，以凝血酶作为目标分析物，构建了两种非标记凝血酶阵列电化学适体传感器。
1. 铁氰化钾电化学探针凝血酶阵列电化学适体传感器的研究。以聚乙烯不干胶掩膜母版法结合金属溅射沉积技术在FR-4玻璃纤维板上组装了由三个小面积金膜工作电极（1.0mm×2.0mm），一个大面积金膜对极（2.0 mm×6.0 mm）和一个厚膜Ag/AgCl参比电极构成的集成化阵列电极系统。采用巯基自组装技术将含巯基的凝血酶适体固定在三个金工作电极表面，巯基己醇（MCH）封闭后获得三阵列凝血酶适体传感器，以电活性物质铁氰化钾作为电化学探针，基于凝血酶适体和凝血酶结合前后铁氰化钾在电极表面传质不同导致电流变化进行凝血酶的测定。采用方波脉冲伏安法，铁氰化钾氧化峰电流的变化值与凝血酶浓度在1.5×10-9~6.3×10-8 mol/L之间呈良好的线性关系，检出限为9×10-10 mol/L。
2. 目标诱导适体转移凝血酶阵列电化学适体传感器的研究。以和上述相同的方法制作含有六个金膜工作电极的集成化阵列电极系统。以阵列电极作为基础电极，将含有24个碱基的凝血酶适体和含有12个互补碱基的巯基单链DNA进行杂交，将获得的巯基DNA-适体双链自组装在六个金工作电极表面，MCH封闭后获得DNA-适体双链修饰的适体传感器；再将电化学信号分子亚甲基蓝富集在适体传感器表面，加入凝血酶后，由于凝血酶-适体复合物的稳定性高于DNA-适体双链稳定性，使适体脱离电极，导致适体传感器表面亚甲基蓝数目减少，电流信号减弱，根据加入凝血酶前后电流的减小进行凝血酶的测定。采用方波脉冲伏安法，亚甲基蓝的氧化峰电流变化值与凝血酶浓度在1.3×10-9~1.3×10-8 mol/L之间呈良好的线性关系，检出限为7×10-10 mol/L。
本章的研究工作表明，聚乙烯不干胶掩膜母版法结合金属溅射沉积技术能够制作性能良好的阵列电极；选择不同的电化学指示剂，可以获得高灵敏度高选择性的非标记凝血酶阵列电化学适体传感器。
第四章 目标诱导适体转移法拉第交流阻抗生物传感器检测溶菌酶。以溶菌酶作为蛋白质的研究模型，基于目标诱导适体转移，以[Fe(CN)6]3-/4-作为电化学探针，研制了非标记可再生型检测溶菌酶的法拉第阻抗适体传感器。将带巯基的部分互补DNA与溶菌酶适体杂交形成的双链通过巯基自组装固定在金电极表面，MCH封闭后获得适体传感器，此时[Fe(CN)6]3-/4-在传感器表面的电子传递电阻Ret较大，目标分析物溶菌酶引入后，溶菌酶与双链上适体相互作用，迫使适体离开双链进入溶液，使得[Fe(CN)6]3-/4-在传感器表面的电子传递电阻Ret减小，根据加入溶菌酶前后[Fe(CN)6]3-/4-在传感器表面的电子传递电阻Ret的减小进行溶菌酶检测。采用法拉第交流阻抗法，进行溶菌酶的测定。实验结果表明，电子传递电阻变化值ΔRet与溶菌酶的浓度在2.0×10-9~4.0×10-8 mol/L之间呈良好的线性关系，检出限7×10-10 mol/L。该适体传感器具有良好的再生性能和高的灵敏度。研究工作也表明，使用较短的互补DNA链与适体形成双链组装的适体传感器能够获得更高的灵敏度。利用互补DNA-适体双链组装适体传感器阵列能够实现对蛋白和小分子的多组分同时测定。
第五章 结论。本论文设计和组装了一种阵列电化学传感器，两种非标记阵列电化学适体传感器和一个非标记法拉第电化学交流阻抗适体传感器。研究工作表明，检测小分子电活性物质的碳纳米管糊阵列电极具有表面容易更新，灵敏度高，试剂和样品消耗小等特点；聚乙烯不干胶掩膜母版法结合金属溅射沉积技术能够制作性能良好的阵列电极；选择不同的电化学指示剂，可以获得高灵敏度和高选择性的非标记凝血酶阵列电化学适体传感器；使用较短的互补DNA链与适体形成双链组装的适体传感器能够获得更高的灵敏度，利用互补DNA-适体双链组装阵列适体传感器能够实现对蛋白和小分子的同时测定。本论文建立的电化学检测新方法和阵列传感器为多种生物活性分子如药物和蛋白质的同时检测奠定了基础。