题目：高效液相色谱电化学发光分析方法的研究

摘  要

 高效液相色谱分析(High-performance liquid chromatography, HPLC)是将高效液相色谱的高分离效率和一定的检测器检测相结合的一种分离分析工具，广泛应用于医药、生化、临床检验，产品的质量检验，环境监测，水、大气、土壤和海洋调查，化肥及农药残留量的检测，植物的营养诊断等方面。特别是近些年来，随着生命科学的不断发展，高效液相色谱在对一些生物分子如蛋白质、多肽、核酸、核苷以及聚合酶链式反应(PCR)扩增产物等的分离、纯化、定量分析方面起着非常重要的作用。其中离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水作用色谱和反相高效液相色谱已经成为蛋白研究的最重要工具。
检测器是高效液相色谱分析系统的重要组成部分，为适应不同的分离分析任务的需求，人们开发出了众多的检测器，这些检测器中的大多数正在不同的领域发挥着重要的作用，但同时每一种检测器或检测方法也总有各自的局限。
电化学发光(Electrogenenrated chemiluminescence, ECL)是化学发光和电化学相结合的产物，是指当对电极施加一定的电压或电流时，在电极表面发生电化学反应，然后电化学反应产物与体系中其它组分或者电化学反应产物之间发生化学反应而产生的发光现象。电化学发光因其具有灵敏度高、线性范围宽、易于操控、仪器简单等特点，多年来一直被广泛研究和使用。同其它许多检测方法一样，在用电化学发光分析复杂基质中的目标组分时，也存在选择性差的问题，因此和一些分离工具相结合以便实现对复杂组分的分离分析便成了一个自然的选择。
本论文共分4章。论文第1章首先对常见的电化学发光体系及其发光原理做了较详细的综述，然后对高效液相色谱-电化学发光检测系统、高效液相色谱-电化学发光联用的应用做了简单介绍；在综述的结尾部分阐明了本课题的立题依据，并对包括高效液相色谱-电化学发光技术在内的电化学发光的发展做了一些展望。
开发新的发光体系一直是电化学发光研究的重要内容之一。在已经存在的众多电化学发光体系中，Ru(bpy)32+的间接电化学发光因其独有的优势得到广泛的研究，而对在一定介质中的直接电化学发光研究较少。在本论文第2章里，对简单、灵敏的硝酸盐介质中的直接电化学发光体系进行了探索，并将其同反相高效液相色谱联用，建立了几种物质的高效液相色谱─直接电化学发光分析的新方法；由于固定化试剂可以降低试剂消耗，在和色谱分析联用时还可以减小检测池死体积，因而引起许多研究者的关注。在固定化试剂电化学发光分析中，信号的长期稳定性是关键之一。尽管文献已经报道了大量的固定Ru(bpy)32+的方法，但实际能用作高效液相色谱检测器的很少；其主要原因正是在连续流动的色谱流动相中，缺乏长期稳定性。因而在论文的第3章，探索了如何解决色谱柱后固定化Ru(bpy)32+电化学发光检测稳定性差的问题，从而设计了一种新的固定化Ru(bpy)32+电化学发光检测池，应用于几种物质的测定，证明其具有长期稳定使用的效果；最后，化学发光和电化学发光除了具有灵敏度高等优势之外，在对那些既没有特征紫外吸收，又没有荧光的化合物比如糖类分子、小分子有机酸、小分子胺类等的检测方面，也有其独特的优势。在论文的第4章，对电生试剂化学发光结合高效液相色谱分离测定还原糖做一些探索。
   论文中研究报告的内容简述如下(第2–4章)：
第2章：直接电化学发光及其和高效液相色谱联用的研究
2.1硝酸盐介质中的电化学发光
一些分子在碱性硝酸盐介质中存在电化学发光现象，其发光行为和在其它一些无机盐介质如硫酸钠、氯化钾以及高氯酸钠中的发光行为不同。实验以氟喹诺酮分子为模型分子，优化了其发光的条件，并对其发光机理做了简单探讨。实验结果表明，氟喹诺酮分子在碱性硝酸钠介质中的发光主要与硝酸根有关，可能是由于硝酸根在电极表面被还原后形成了某种高能中间体，然后这种高能中间体将能量转移至氟喹诺酮分子或其氧化产物，然后发生光辐射。研究有助于对硝酸盐介质中类似发光现象的机理的理解。
2.2高效液相色谱直接电化学发光测定氧氟沙星
    氧氟沙星在近中性硝酸钠溶液中存在电化学发光现象，荧光和电化学实验表明其发光机理可能是由于水的分解形成活性氧中间体，然后氧化氧氟沙星而发光。实验对氧氟沙星的发光条件进行了优化，结合高效液相色谱分离，将其用作色谱检测器，测定了血清中的氧氟沙星。在优化的条件下，氧氟沙星浓度在1.0×10?8 g mL-1–4.0×10?6 g mL-1范围内和电化学发光强度成良好线性，回归方程为：I = 803.7C +81.4 (C：氧氟沙星浓度，10-6 gmL-1, R2 = 0.9963)。检出限为 4×10?9 g mL-1 (S/N=3)。方法比较灵敏，而且非常简单，整个分离测定用时小于5 min。此外，由于氧氟沙星在硝酸盐介质中有很强的电化学发光强度，有望成为一种新的电化学发光试剂。
2.3高效液相色谱直接电化学发光测定萘普生
对含萘普生的碱性硝酸钠溶液进行电解时伴随着电化学发光，发光强度随电流的增加而增加。实验结果表明，其发光分别位于两个电位区间内：<2.0 V (ECL–1)和>2.5 V (ECL–2)。其中ECL–1可能是由于水分解产生的活性氧氧化萘普生而发光，而ECL-2则可能是萘普生或其氧化产物和对电极上产生的物质相互作用而发光。结合高效液相色谱，该电化学发光方法已用于尿液中萘普生的测定，方法简便可行。在优化的条件下，萘普生浓度和发光强度在4.0×10?8 g mL-1–2.0×10?6 g mL-1成较好的线性关系，回归方程为 I = 1077.1C +12.05 (C：萘普生浓度, 10-6 gmL-1)，相关系数为0.9930，检出限为 2×10?8 g mL-1 (S/N=3)。
2.4高效液相色谱直接电化学发光测定卡托普利
卡托普利分子本身没有荧光，也没有特征紫外吸收峰，无法用荧光直接测量，而用紫外检测时则不得不使用其末端吸收，因而干扰较大，灵敏度较低，测定误差也比较大。实验发现，对含卡托普利的酸性硝酸钠溶液进行电解时伴随着电化学发光，发光强度随电流的增加而增加。其发光机理可能是由于水分解产生的活性氧氧化卡托普利生成其相应的二硫化物而发光。结合高效液相色谱分离，该电化学发光方法已成功用于人血清中卡托普利的测定。在优化的条件下，卡托普利在4.0×10?6 g mL-1–2.0×10?3 g mL-1和发光强度成较好的线性关系，回归方程为 I = 3404.5C +313.8 (C：卡托普利浓度, 10-3gmL-1)，相关性系数为0.9975，检出限为2×10?6 g mL-1 (S/N=3)。
2.5高效液相色谱直接电化学发光测定叶酸
    实验对叶酸在一些无机盐支持电解质溶液中的发光行为进行了比较，发现在硝酸盐介质中有最大发光强度，其发光最大峰位于460 nm左右。将其用作色谱柱后检测测定尿液中的叶酸时，分离条件和发光条件之间耦合较好，方法操作非常简单。在优化的条件下，叶酸在1.0×10?7 gmL-1–1.0×10?5 gmL-1和发光强度成较好的线性关系，回归方程为  I = 174.62C +13.90 (C：叶酸浓度, 10-6 gmL-1)，相关性系数为0.9985，检出限为5×10?8 gmL-1 (S/N=3)
第3章：高效液相色谱/固定化Ru(bpy)32+电化学发光分析的研究
3.1高效液相色谱/固定化Ru(bpy)32+电化学发光测定盐酸依托必利
本文提出了一种稳定非共价法固定化Ru(bpy)32+电化学发光的方法。方法是在溶液中加入微量Ru(bpy)32+来维持阳离子交换树脂上吸附的Ru(bpy)32+量的稳定，以达到稳定的检测。实验表明发光主要来自吸附在树脂表面的Ru(bpy)32+，而不是溶液中的Ru(bpy)32+。将基于这一原理制作的检测器用于色谱柱后检测血样中的盐酸依托必利，证明该方法可行。该检测器可以长期使用，而且这种提高非共价固定化Ru(bpy)32+电化学发光稳定性的方法也可以用于其它一些基于相似原理固定Ru(bpy)32+的检测器或传感器中。在优化的条件下，盐酸依托必利在1.0×10?8 g mL-1–1.0×10?6 g mL-1和发光强度成良好的线性关系，回归方程为 I = 1247.8C +37.33 (C：盐酸依托必利的浓度, 10-6 gmL-1)，相关性系数为0.9992，检出限为3×10?9 g mL-1 (S/N=3)。
3.2高效液相色谱/固定化Ru(bpy)32+电化学发光测定氢氯噻嗪
由于阳离子交换树脂对有机溶剂的耐受性好，且对Ru(bpy)32+有很强的吸附能力，本文将其用作固定Ru(bpy)32+的材料。但由于Ru(bpy)32+的泄漏，造成电化学发光信号不稳，因而不能直接用作色谱检测器。实验发现在流动相中加入微量的Ru(bpy)32+并充分平衡后可以获得稳定的电化学发光信号。将其用作色谱检测器测定血清中的氢氯噻嗪的实验结果证实这种提高非共价固定化Ru(bpy)32+电化学发光检测稳定性的方法是可行的。在优化的条件下，氢氯噻嗪在5.0×10?8 g mL-1–2.5×10?5 g mL-1和发光强度成良好的线性关系，回归方程为I = 324.15C +57.93 (C：氢氯噻嗪浓度, 10-6 gmL-1)，相关性系数为0.9990，检出限为2×10?8 g mL-1 (S/N=3)。对1.0×10?7 g mL-1氢氯噻嗪连续9次测定的相对标准偏差(RSD)为2.7%。
3.3高效液相色谱/固定化Ru(bpy)32+电化学发光测定盐酸普萘洛尔
实验以阳离子交换树脂为固定Ru(bpy)32+的材料，并在流动相中加入Ru(bpy)32+以补偿因Ru(bpy)32+流失而造成的信号下降。结合高效液相色谱分离，将该方法用于尿样中普萘洛尔的测定。在优化的条件下，普萘洛尔在5.0×10?8 g mL-1–2.0×10?5 g mL-1和发光强度成良好的线性关系，回归方程为 I = 375.5C +107.7 (C：普萘洛尔浓度, 10-6 gmL-1)，相关性系数为0.9993，检出限为2×10?8 g mL-1 (S/N=3)。
第4章：高效液相色谱/在线电生[Cu(HIO6)2]5––Luminol化学发光测定还原糖
    实验结合高效液相色谱分离和在线电生Cu[(HIO6)2]5–化学发光检测，建立了一种测定还原糖的新方法。经过对葡萄中的葡萄糖、果糖和牛奶中的乳糖测定证实，这一方法在分离测定这些样品中的糖类分子时，Cu[(HIO6)2]5––luminol化学发光体系可以选择性的响应糖类分子，而基质中的其它组分对测定几乎没有干扰。在优化的实验条件下，葡萄糖、果糖和乳糖的浓度和发光强度之间成较好的线性关系，回归方程分别为ΔI = 2391.4C+112.11，ΔI = 4155.6C+ 66.928，ΔI = 346.84C +55.61；检出限分别为4，3，20 µg mL-1。