题目：核黄素适体电化学传感器的研究

核酸适体(aptamer)是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。它能与多种目标物质(例如无机离子、有机小分子、生物大分子、细胞等)高特异性、高选择性地结合。适体与目标分子复合物的离解常数在10-6-10-12 mol/L间，跟常规生物亲合对(如抗原-抗体)的亲合性相当或更优。同时适体又具有常规识别分子(如抗体和酶)所不具备的一些优点，如可商业化的体外化学合成、结构的可修饰性、良好的化学稳定性以及热变性的可回复性等，因而适体作为一类新型分子识别物质已被广泛应用于生物传感等分子识别和应用研究领域。目前，电化学适体传感器因其具有灵敏度高、选择性好、廉价等特点而备受关注，包括标记型和非标记型电化学适体生物传感器。非标记型电化学适体传感器主要是根据适体与配体结合前后电流、电位、电容或阻抗的改变对目标物进行检测的电化学传感器，因其不需要进行标记过程且操作简单而广受关注。
含碱基缺失位点(abasic site，AP site)的ds-DNA是最近报道的一类新型的适体，它主要是通过包括氢键在内的一些非共价相互作用选择性的结合一些有机小分子。AP site是由DNA双链自发的水解导致嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来而形成的脱碱基位点，通过人工构建AP site可以在ds-DNA中形成一个氢键形成所需的疏水微腔。许多有机小分子如吡啶、蝶呤、黄素等可以通过氢键作用结合到ds-DNA中AP site对面的碱基，达到识别的目的。就小分子识别而言，此类适体具有比单链适体更强的结合能力且在识别和结合过程中不会出现明显的结构变化。
本论文的目的是研制以含有AP 位点的适体ds-DNA为分子识别物质， 以聚合电解质与含有AP 位点的适体DNA的分子识别物质进行层层自组装的一种新型电化学适体传感器。 以核黄素为分析物, 建立具有选择性富集作用的高灵敏度检测黄素类物质的电化学适体传感器。本论文研究工作是在国家自然科学基(No.20805029)项目的资助下完成的。
本论文分为两章：第一章为综述部分，第二章为研究报告部分。
第一章是综述部分。综述部分介绍了适体的概念、特点，电化学生物传感器的原理及分类，相关的固定化方法等。重点介绍了电流型适体生物传感器及相关电化学分析技术。最后阐述了本论文的研究背景、研究意义、研究目的和研究内容。
第二章是研究报告部分。研究了含AP site的ds-DNA适体修饰金电极的制备及其对核黄素（VB2）的选择性富集和电化学检测。基于文献报道，含胸腺嘧啶(thymine，T)碱基相对AP site的ds-DNA适体能够特异性的识别核黄素分子，结合常数达到了105数量级。我们利用静电层层组装的方式将ds-DNA适体固定在金电极表面，通过固定化ds-DNA适体识别并结合核黄素使核黄素富集到多层膜内，之后在空白缓冲液中进行电化学检测，实现了核黄素的选择性检测。首先在处理干净的金电极表面吸附一层ds-DNA适体，因DNA磷酸骨架荷负电从而使电极表面荷负电。然后将组装了ds-DNA适体的金电极浸泡在聚阳离子聚合物PEI溶液中，通过静电作用将PEI组装在ds-DNA层上，这样在电极表面就形成了一层aptamer /PEI双层。重复上述步骤即可在电极表面获得希望层数的(aptamer/PEI)n多层膜。然后将组装了(aptamer/PEI)n多层膜的金电极浸泡在一定浓度的巯基己醇(MCH)的乙醇溶液中，MCH会封闭电极表面没有被DNA占据的位点，从而降低了非特异性吸附。将组装了(aptamer/PEI) n多层的金电极浸入核黄素溶液中，核黄素就会结合到固定化ds-DNA适体中从而达到选择性富集的目的。将富集了核黄素的电极转入空白缓冲溶液中进行电化学检测，从而消除一些可能的共存离子的干扰。研究结果表明核黄素在-0.30V(vs AgCl)处出现了一个明显的还原峰，符合核黄素在镶嵌到ds-DAN中状态下的电化学行为。对比试验表明，同样条件下用全匹配DNA 组装的多层膜修饰电极并没有表现出任何信号，证明我们制备的多层膜能够有效的富集核黄素。我们还对(aptamer/PEI)n多层膜的层数及核黄素的富集时间等进行了考察。结果表明(aptamer/PEI)双层达到八层后核黄素的还原电流即达到最大。核黄素的还原峰电流ip(A)与其浓度c (mol/L)在1.0×10-6~1.0×10-8mol/L范围内呈良好的线性，检出限为4×10-9 mol/L(S/N=3)。干扰实验表明核黄素的衍生物FMN和FAD都没有响应，说明用(aptamer/PEI)n修饰的电极对核黄素的检测表现出了很好的选择性和灵敏度。
本研究工作提出了以含T碱基相对的AP site的ds-DNA适体作为分子识别物质，结合静电层层组装技术制备了一种新的检测核黄素的电化学适体传感器。通过静电层层组装的方式实现了适体在金电极表面的固定化并提高了适体在电极表面的固定化量，通过富集分离的手段提高了检测的选择性和灵敏度。本论文为研制高灵敏度的小分子电化学适体传感器提供了新思路。