题目：单核苷酸多态性荧光检测方法的研究

单核苷酸多态性(SNPs)是DNA多态性的一种，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致，由此引发DNA双螺旋结构中突变位点的产生，导致DNA损伤。SNPs在医学、遗传学、生物学等领域受到越来越多的关注。因而，建立简单快速的SNPs检测方法是后基因时代一个重要的研究课题。本文选择双链DNA中的突出结构和单碱基错配结构这两个突变位点作为研究对象，选择2－氨基－7－甲基－1,8吡啶（AMND）为荧光探针，拟建立对双链DNA（ds-DNA）中的突变位点有高选择性识别的荧光检测方法。
本文包括综述和研究报告。
第一部分为综述，介绍了单核苷酸多态性的定义、分类、特点及应用，详细综述了SNPs分型的研究进展，最后介绍了本论文的研究目的和内容。
第二部分为研究报告，由两部分组成。第一部分利用能通过氢键识别特定碱基的探针小分子，研究了探针小分子与含突出位点（bulge）双链DNA的相互作用及分子识别过程。选择AMND为探针小分子，针对目标基因片段设计了不同序列的探针DNA，利用探针DNA与目标基因片段杂交形成含突出位点(bulge)的双链DNA，该双链DNA中目标核苷与其面对的bulge 位点形成一个疏水的微腔体，探针小分子嵌入该疏水腔体，通过与bulge 位点对应的目标碱基氢键作用，这一结合过程伴随探针小分子的荧光淬灭，通过监测荧光淬灭现象的发生进行突出位点的识别，建立了SNPs荧光检测方法。AMND荧光的淬灭程度与突出位点对应碱基类型相关，表现为：C>T>A>G；通过解旋温度（Tm）测定和荧光光谱扫描，考察了在含突出碱基C的双链DNA中，突出碱基C两侧的相邻碱基对荧光小分子AMND与突出碱基C键合的影响，发现在含突出碱基C的双链DNA中，无论在突出碱基C的5′或3′含有G–C 和、或 C–G碱基对，这样的序列与AMND作用会表现比较明显的淬灭效率，解旋温度增加值（△Tm）也越大；同样通过荧光小分子AMND与含不同目标碱基（A，T，G，C）的双链DNA以不同浓度比结合的荧光滴定实验，固定AMND的浓度，连续改变含C/C错配碱基的ds-DNA的浓度，计算出AMND与含突出碱基C的结合常数为4.8×105 M-1，这个结果略低于相应的含AP位点的双链DNA中与目标核苷为C的结合常数(≥106 M-1)；考察了双链DNA的长度对AMND和目标核苷键合的影响，结果显示DNA链的长度对于AMND的荧光淬灭情况影响不明显，说明含突出碱基的双链DNA本身已足够稳定，实验中我们无需选择太长的链来增加稳定性，提高灵敏度；最后考察了两组应用基因序列PGR（rs3740753）和p53(P177R)中的C/G转换，前者是与雌激素和黄体酮有关的基因序列，它们常常作为乳腺癌的评判标准；后者属于癌症抑制基因序列。在完全互补的ds-DNA、含突出位点C的ds-DNA和含突出位点G的ds-DNA的溶液中分别加入AMND，经紫外灯照射下通过肉眼即可分辨出这三种溶液的荧光强度的不同，即：通过目视观察到单核苷酸多态性中C/G的转换。实验结果表明：选择的荧光杂环小分子AMND能够作为碱基替代物去识别目标碱基，成功实现了对ds-DNA中突出位点的识别和检测。
研究报告的第二部分依然选择AMND－这一荧光小分子作为探针去识别双链DNA中的单碱基错配。在设计的含一对错配碱基的双链DNA中，AMND能进入双链DNA中的单碱基错配位置，通过与错配碱基氢键作用引发探针小分子的荧光淬灭，进行双链DNA中碱基错配位点的识别。实验结果表明AMND与含八种不同错配碱基的双链DNA分别作用，AMND荧光的淬灭程度与错配碱基类型有关，当错配的形成是与碱基C相关的碱基错配，如：C/C，C/A，C/T时，均表现出相对明显的荧光淬灭效率，其中含C/C碱基错配情况下，荧光淬灭最明显，AMND对C/C碱基表现出明显的选择性；通过解旋温度（Tm）测定和荧光光谱扫描，考察了在含错配碱基C/C的双链DNA中，错配碱基C/C两侧的相邻碱基对荧光小分子AMND和错配碱基C/C键合的影响，发现错配碱基两侧相邻的碱基对二者的键合有影响，其中含不同相邻碱基的含C/C错配的ds-DNA中，组成双链的G-C含量越高，加入荧光小分子后双链越稳定，表现为荧光淬灭程度越大，解旋温度增加值（△Tm）越大；固定AMND的浓度，连续改变含C/C错配碱基的ds-DNA的浓度，测量AMND在401nm处的荧光强度，AMND的荧光随ds-DNA浓度的增大而降低，拐点出现在 [DNA duplex]/[ Amiloride] = 1：1，表明AMND和存在C/C错配碱基的ds-DNA是1：1的结合，计算结合常数为3.1×105 M-1。实验证明，论文中设计的检测DNA双链中的突出位点的方法同样适用于检测双链DNA中单碱基错配这一突变位点，这一方法也有望用于其他SNPs的检测。
本论文建立的均相、非标记的利用荧光小分子探针检测SNPs的方法，将为SNPs分型方法的基础和应用研究提供一些新思路，在SNPs分型方法研究及小分子和DNA相互作用研究领域具有一定的意义。