题目：氯过氧化物酶CPO的催化活性与稳定性研究

氯过氧化物酶（Chloroperoxidase，CPO）是已知的血红素过氧化物酶超级家族中应用最广泛的生物催化剂。因其独特的活性位点结构而具有卤过氧化物酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素P450等多种酶的催化活性。近年来，CPO在不对称有机合成、手性药物的绿色制备、环境毒物降解以及农药生产和原油提炼方面都有极其广泛的应用。但高温、强酸、强碱等极端条件以及高浓度的过氧化氢存在时，游离CPO容易变性失活，这限制了其产业化应用。所以研究基于特定底物对CPO失活和激活的机理，以探索极端条件下提高CPO稳定性的途径，建立CPO的稳定化平台，对开发CPO的应用潜能具有重要的意义。
本文在查阅并分析大量文献的基础上，采用添加剂法，以CPO催化卤化2-氯-5,5-二甲基-1,3-环己二酮和催化氧化吲哚为模型反应，选用含有羟基和硫、氮的化合物作添加剂，研究了添加剂对CPO活性的影响。结果发现，25 ?C时，巯基乙酸使CPO的氯化和氧化活性分别提高了20%和24%，是有效的添加剂。壳聚糖能使CPO的氯化活性提高到32%，并且使氯化反应的最佳pH值从2.75移至5.75，这是较为弱酸性的环境，有利于CPO稳定。文中还从动力学方面进行了研究，动力学参数表明：巯基乙酸和壳聚糖使CPO对底物的亲和性与专一性都得到了提高。我们并对巯基乙酸和壳聚糖作为添加剂时，对CPO催化性能得以改善的机理进行了初步讨论。
本文还研究了精氨酸导致的CPO失活。实验发现，精氨酸存在时，棕红色的CPO能快速的转化为绿色，同时CPO在398 nm处的特征吸收峰逐渐消失，并红移至425 nm的位置。因此本文采用紫外可见吸收光谱、荧光光谱和激光拉曼光谱等谱学方法研究了精氨酸与CPO的相互作用。还利用差式紫外可见吸收光谱法，求算出酶复合物CPO-arginine中精氨酸与CPO分子个数比为1:1（即配位数为1），并从动力学方面进行了讨论。本文还基于实验事实对精氨酸导致的CPO失活机理进行了推测。
另一方面，酶固定化技术是实现酶重复连续使用和稳定性改善的有效手段。本文采用两种固定化方法：一、物理吸附法。以磁性高分子微球为载体，通过静电作用将具有顺磁性的CPO包覆在磁性微球表面，提高了氯过氧化物酶的稳定性。二、分子识别法。以经表面活化处理的xMagTM异硫氰酸根末端磁性高分子微粒为载体，基于生物素与亲和素的特异识别，使生物素化的酶与亲和素功能化的磁粒相互作用来完成酶的固定化。
研究了两种方法固定化CPO的结构和表面性质，比较了游离CPO和固定化CPO间酶学性质的差异，并将磁粒固定化CPO应用于酚类的去除和染料的降解。主要结果如下:
1. 物理吸附法: 与游离CPO相比，热稳定性、储存稳定性均有明显提高; 固定化CPO的米氏常数Km值减小，然而kcat/Km值增加，这说明固定化酶对底物的亲和力及专一性得到增强。
2.分子识别法: 与游离CPO相比，固定化CPO对底物的亲和力及专一性也得到有效提高，同时热稳定性、储存稳定性以及对H2O2的耐受能力都有所改善。
3. 固定化CPO催化降解酚类中的间苯二酚和两种染料橘黄II、水溶性苯胺蓝的研究结果表明：水溶性苯胺蓝可以被CPO高效催化降解至完全。反应2 h时，降解率已高于97%。固定化CPO也可以有效降解间苯二酚和橘黄II。反应2 h后，反应基本达到平衡，间苯二酚的降解率达到最大值82.6%。但对于橘黄Ⅱ的降解效果不甚理想，反应时间为0.5 h时，橘黄Ⅱ降解率为35%，此后降解率不再明显增加。