题目：杏仁蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的酶法制备

摘 要
高血压病已成为人类健康的第一杀手。据报道，全世界每年因高血压引起的心脑血管疾病的死亡人数超过1200万，预防和治疗高血压病是当今社会十分重要的课题。血管紧张素转化酶（Angiotensin Ⅰ-Converting Enzyme，ACE）在血压调节中起着重要作用。目前用于降血压的药物，其降压原理主要是抑制ACE的活性。食物蛋白源ACE抑制肽因其安全性高，副作用小，易吸收，成为活性肽研究领域的热点，这些ACE抑制肽在开发具有降血压功能的功能性食品中具有广阔的应用前景。
杏仁是蔷薇科李属植物——杏（Prunus armeniaca L.）的种子，脱苦、脱苷的杏仁是一类优质的植物蛋白资源，其氨基酸组成平衡合理，营养价值较高，研究杏仁蛋白的开发利用是促进我国杏仁产业健康发展、实现杏仁加工产业化不可忽视的一个方面。
本文以陕西铜川产苦杏仁为原料，主要从以下几个方面对杏仁蛋白及其ACE抑制肽进行了研究：
一是确定了杏仁蛋白的碱溶酸沉提取工艺，采用冷冻干燥法制备杏仁蛋白，并对其性质进行了研究；
二是采用6种商业蛋白酶水解杏仁蛋白，利用高效液相色谱法对水解产物的ACE抑制活性进行检测，确定了为得到具有较好ACE抑制效果的水解物的最佳酶系；
三是采用Alcalase碱性蛋白酶对杏仁蛋白进行酶解，对酶解条件进行了研究，得到最佳酶解工艺；
四是通过超滤对ACE抑制肽进行了分离分级，对不同分子量大小杏仁多肽的ACE抑制活性进行了研究。
研究结果表明：
    1、基于二次回归正交旋转组合设计试验，杏仁蛋白碱溶酸沉提取法最佳工艺参数为：碱溶pH值10.0，料液比1:13，提取温度45℃。在此条件下提取时间30min，重复提取两次，提取率可达87.58%。然后在pH为4.5时进行酸沉，将沉淀水洗至中性并冷冻干燥，得到的杏仁蛋白粉中粗蛋白含量为80.73%。
    2、按照WHO建议的以鸡蛋蛋白质所含氨基酸比例为参考标准，杏仁蛋白的氨基酸评价分数为69，其氨基酸组成丰富，氨基酸分数高，组成平衡合理，是一类优秀的蛋白质资源。
3、根据Osborne法分级测定，杏仁蛋白中清蛋白含量较高，达85%以上，其次是球蛋白，约为6%，而醇溶蛋白、谷蛋白等含量较少。
    4、杏仁蛋白的等电点为pH=4.5左右。在等电点时其溶解度最低，在强酸强碱pH条件下，其溶解度较大。
5、采用Protamex、Alcalase、Neutrase、Flavourzyme、Proleather FG-F、木瓜蛋白酶等六种蛋白酶对杏仁蛋白冻干粉进行水解，利用RP-HPLC测定水解物对ACE的抑制活性，以水解度（DH）和水解产物对ACE的抑制率为指标对酶解过程进行了分析。结果表明，Alcalase碱性蛋白酶对杏仁蛋白有较好的水解效果，其水解物对ACE抑制率较高，当水解物浓度为2.5mg/mL时，ACE抑制率为74.62%。
    6、以酶解温度、酶底比、底物浓度、pH值为指标对碱性蛋白酶Alcalase酶解杏仁蛋白工艺进行了优化，为得到较大活性的ACE抑制肽，最佳水解条件为：pH值7.0，温度50℃，酶底比（[E]/[S]）2%，底物浓度2%。该条件下经60min水解，其水解物的ACE抑制活性较高，此时的水解度为12.23%，得到的水解物对ACE的IC50为0.38mg/mL。
7、经截留分子量5KDa、1KDa的超滤膜对Alcalase酶解得到的杏仁多肽进行分级分离，结果发现，不同分子量范围的多肽均对ACE活性有抑制作用，其ACE抑制率随分子量的减小而增大。分子量低于1KDa的杏仁多肽的ACE抑制活性最高，其IC50为0.167mg/mL。
8、采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱层析法测定ACE抑制肽（＜1KDa）的分子量，结果主要得到一个洗脱峰，所对应的分子量范围为173.3~411.3Da。
9、氨基酸分析结果显示，ACE抑制肽的疏水性氨基酸含量较高。ACE抑制肽的溶解性较好，溶解度接近100%。
10、经体外模拟胃肠消化后，杏仁蛋白ACE抑制肽仍保持较高抑制活性。