题目：苹果籽油甾醇的分离、提取及其功能性评价

甾醇是食物中天然存在的微量成分，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇。甾醇具有降低血脂和胆固醇、消炎退热、清除自由基、抗肿瘤及护养皮肤等多种生理功效，在医药、食品、化妆品及饲料行业中的应用日益广泛。大量的资料和实验室研究表明，摄入甾醇可以降低人群许多慢性病的发病率，如冠状动脉硬化性心脏病、癌症、良性前列腺肥大等。目前，甾醇主要从大豆油脱臭馏出物中提取，从苹果籽油中提取甾醇的工艺参数以及苹果籽油甾醇的分离分析方法、功能性评价等研究都鲜见报道。本课题以苹果籽油为原料，首先对苹果籽油甾醇的提取工艺进行了优化，之后对粗甾醇进行纯化，获得了纯度较高的甾醇，接着对甾醇进行了系统地分析测定和功能性研究，对苹果渣资源深度转化进行了探索，以期为我国传统苹果浓缩汁加工产业开拓新的经济增长点，为甾醇的生产找到新的资源。主要研究成果如下：
1. 测定了苹果籽油的主要理化性质，其水分及挥发物含量为0.1%；相对密度为0.9181；折光指数为1.4739；酸价为14.6 mgKOH/g；皂化值为188.9 mgKOH/g；过氧化值为3.2 meq/Kg；碘值为120.1 g/100g；磷脂含量为0.46 μg/mL；甾醇为9.4~12 mg/g，包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇。
2. 比较了无水乙醇、甲醇、乙醚、石油醚、正己烷和丙酮六种溶剂对苹果籽油甾醇的提取效果，结果显示无水乙醚可以得到最大的提取率，因此，选择乙醚为最佳溶剂。
3. 采用响应曲面法（Response surface methodlogy, RSM）对苹果籽油甾醇的提取工艺参数进行优化，建立了二次多项数学模型，验证了模型的有效性，并考察碱浓度、液料比、皂化时间和皂化温度对甾醇提取的影响。结果显示，碱浓度（A）、液料比（D）、碱浓度的平方项（A2）、皂化时间的平方项（C2）、液料比的平方项（D2）对苹果籽油甾醇提取的影响高度显著；皂化温度（B）和液料比（D）对苹果籽油甾醇的提取显著。4个因素对影响苹果籽油甾醇提取率的大小顺序依次为：液料比（D）＞碱浓度（A）＞皂化温度（B）＞皂化时间（C）。通过Box-Behnken响应曲面设计法分析，得到了苹果籽油甾醇提取试验的最佳技术参数为：碱浓度0.6 mol/L，皂化温度86℃，皂化时间123 min，液料比4.4︰1；在此条件下进行3次提取试验，其提取率为90.25%±0.59%，响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好。可以用本模型来控制该提取过程的各个工艺参数。通过对试验结果的优化，得到了碱浓度、液料比、皂化时间和皂化温度4个因素为自变量、以甾醇提取率为因变量的回归方程：    Y=90.19+1.75A+0.46B+0.045C+2.58D-2.73A2-0.84B2-1.69C2-3.68D2+0.70AB+0.17AC+0.26AD+1.23BC-1.58BD+0.090CD。
4. 采用薄层色谱、制备液相色谱分离纯化苹果籽油甾醇，并用气相色谱鉴定甾醇的纯化效果。确定薄层色谱分离甾醇的条件：展开剂为乙醚︰石油醚=3︰7（V/V），显色剂为1% 三氯化铁溶液，在此条件下斑点清晰且易于辨认。确定制备液相色谱分离甾醇的条件为：流动相乙醚与石油醚的体积比为3︰7，流速为20 mL/min，时间为300 min，进样量为10 mL。采用气相色谱分析苹果籽油甾醇的纯化物，得到豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇四种主要甾醇的气相色谱图，结果表明分离纯化的效果很好。
5. 对分光光度法测定苹果籽油甾醇含量的测定条件进行优化，检测最大吸收波长为680 nm，试验确定了苹果籽油甾醇的标准曲线方程为Y=0.276x+0.0068，相关系数为R2=0.9986。确定了分光光度法测定甾醇的最佳显色条件为：乙醇用量为2 mL，磷硫铁显色剂用量为2 mL，苹果籽油甾醇样品在50℃水浴反应15 min。该方法有较好的稳定性、精密度和回收率，操作方法简便，并且灵敏度很高，适用于测定甾醇类物质的含量，也可用于甾醇的生产管理和产品质量的分析工作中。
6. 苹果籽油甾醇的体外抗氧化性试验包括对其总还原能力、清除 [DPPH•] 、 [•OH] 及[O2－•] 能力的研究，均采用维生素E和BHT作为对照。结果表明，苹果籽油甾醇的总抗氧化能力随着浓度的增加而增强；对 [DPPH•] 具有很强的清除作用，在试验的质量浓度范围内呈现出良好的量效关系，随着浓度的增加清除率也逐渐增强，IC50为7 μg/mL；具有清除·OH自由基的作用，在甾醇样品为0~100 μg/mL质量浓度范围内，清除 [·OH] 自由基的作用随着质量浓度的增加而增强，其IC50为30 μg/mL；对 [O2－•] 具有较强的清除能力，随着其浓度的增大其清除效果不断增强，在17 μg/mL的质量浓度时可以对 [O2－•] 达到半数清除。发现甾醇的抗氧化性高于维生素E和BHT，其是否会成为一种新型抗氧化剂，代替维生素E和BHT等其他的抗氧化剂，有待于进一步的研究和分析。
7. 苹果籽油甾醇的抑菌试验结果表明，甾醇对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有较强的抑菌性，对蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌有抑菌作用；对黑曲霉没有抑菌性。测定苹果籽油甾醇对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为24 μg/mL；对金黄色葡萄球菌为30 μg/mL；对大肠杆菌为42 μg/mL；对蜡样芽孢杆菌为42 μg/mL。在碱性环境下，苹果籽油甾醇抑菌活性较弱，随着pH值的升高，抑菌能力逐渐增强，而在5~6时甾醇的抑菌活性最强；在0~80℃的温度范围内具有很好的抑菌活性，抑菌能力变化不大，因此甾醇具有常温的抑菌性。