题目：青果多酚的提取、分离及体外抗氧化活性研究

多酚是广泛存在于植物中的一类多羟基酚及其衍生物的总称。多酚的邻位酚羟基极易被氧化，对活性氧等自由基也有较强的捕捉能力，因此具有很强的抗氧化活性和清除自由基的能力，能有效预防癌症、心血管疾病和神经组织退化等多种疾病。青果是我国特产，在南方多个省份均有广泛分布，对青果多酚的开发利用具有重要的现实意义。
本文主要从以下几个方面对青果多酚进行试验研究：
1.以多酚含量和抗氧化活性为指标对青果与其他85种药食两用植物进行比较，对青果多酚与人工合成抗氧化剂BHT的抗氧化活性进行比较。
2.选择适合提取青果多酚的溶剂，利用Design-expert软件建立青果多酚的提取模型，并对模型进行验证；
3.选择适合纯化青果多酚的大孔吸附树脂，比较不同浓度乙醇洗脱物的抗氧化活性；
4.利用不同极性溶剂对青果多酚进行萃取，研究萃取物的纯度和抗氧化活性，确定青果多酚抗氧化活性成分所在的极性区间；
5.利用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20进一步分离青果多酚，采用高效液相色谱（HPLC）分析青果多酚的组成。
6.采用抗氧化活性跟踪法对青果多酚进行研究，研究青果多酚抗氧化活性成分所在的区间及其物质组成。
研究结果表明：
（1）青果的多酚含量和抗氧化活性均远超其他药食两用植物。青果多酚抗氧化活性优于BHT，对DPPH•的半数清除浓度IC50为0.140mg/mg，为BHT的6.336倍。
（2）甲醇、乙醇和丙酮三种溶剂在最适浓度下，对青果多酚的提取能力大小顺序为：甲醇＞乙醇＞丙酮，试验选择甲醇为提取溶剂。
（3）基于星点设计（CCD）青果多酚提取试验结果表明：甲醇浓度（A）、提取温度（B）和提取时间（C）极显著；甲醇浓度平方项（A2）、提取温度（B2）、提取时间（C2）极显著；提取温度与提取时间的交互项（BC）极显著，甲醇浓度与提取时间的交互项（AC）显著，甲醇浓度与提取温度的交互项（AB）不显著，各影响因素对于青果多酚提取率的影响不是简单的线性关系。通过Design-Expert软件,建立了以甲醇浓度、提取温度、提取时间为自变量的青果多酚提取模型：
Y=0.39+4.883*10-3A+2.514*10-3B+3.064*10-3C-7.919*10-4AB-1.368*10-3AC-1.944*10-3BC-2.419*10-3A2-1.197*10-3B2-1.298*10-3C2
根据此模型得到青果多酚的最佳提取工艺参数为：甲醇浓度为78.2%，提取温度64.4℃，提取时间7.4h；以此条件进行试验，得到提取量平均值为0.3926 g/g DM，与模型预测值的提取量值0.3932 g/g DM相比，相对误差为1.53%，证明该模型是合适有效的。在该提取模型下得到的青果多酚纯度为62.63%，总抗氧化能力FRAP值为16.15mmol/g，对DPPH•的半数清除浓度IC50为0.140mg/mg。
（4）采用乙酸乙酯、正丁醇2种不同极性的溶剂萃取青果粗多酚水溶液，得到乙酸乙酯层（MA）、正丁醇层（MB）、残留水层（MR）3种不同极性萃取层。与粗多酚相比，MA和MB的纯度和抗氧化活性均有了一定的提高，其中，MB的DPPH•清除效果优于人工合成抗氧化剂TBHQ。MA和MB的纯度分别为73.42%和77.05%， MB总抗氧化能力FRAP值为26.97mmol/g，对DPPH•的IC50为0.108mg/mg；MA总抗氧化能力FRAP值为24.25mmol/g，对DPPH•的IC50为0.117mg/mg。
（5）AB-8、NKA-9、D4020这3种大孔吸附树脂对青果多酚的静态吸附和洗脱试验结果表明：NKA-9树脂的吸附率和洗脱率分别为为83.79%和84.23%，均高于其它另外的2种树脂，试验选择NKA-9树脂作为多酚纯化用树脂。
（6）采用水-乙醇溶液对NKA-9树脂上吸附的青果多酚进行梯度洗脱的结果表明：40%的乙醇洗脱物抗氧化活性最高，其总抗氧化能力FRAP值为29.10mmol/g，对DPPH•的半数清除浓度IC50为0.073mg/mg，纯度可达87.60%。其次，抗氧化活性较强的依次为50% 、30%和60%的乙醇洗脱物，30%-60%的乙醇洗脱物DPPH•清除效果均优于抗氧化剂Vc。
（7）葡聚糖凝胶Sephadex LH-20对青果多酚分离效果较好，能得到两个组分F-1、F-2；两组分均具有较强的抗氧化活性。其中，组分F-1的FRAP值为32.57mmol/g，DPPH•的IC50为0.070mg/mg；组分F-2的FRAP值为36.83mmol/g，对DPPH•的IC50为0.058mg/mg。
（8）采用外标法对青果多酚进行HPLC分析，结果表明：青果多酚组成复杂，除含有没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、芦丁、根皮苷、鞣花酸等9种单体酚外，还含有三种重要的未知物质。在已确定的单体酚中，含量相对较高的为绿原酸、原儿茶酸、没食子酸、鞣花酸。
（9）青果多酚抗氧化活性最强的区间为组分F-2，其获得途径为：青果粗多酚经NKA-9大孔树脂吸附，40%乙醇洗脱，然后葡聚糖凝胶Sephadex LH-20进一步分离。组分F-2的物质组成中能够确定的有：原儿茶酸、绿原酸、香豆酸、阿魏酸、芦丁、根皮苷，其比例分别为：60.21︰65.16︰3.84︰0.45︰3.65︰1.52；另外尚有几种未确定结构的单体酚，有待进一步研究。