题目：双酚A对中国林蛙精巢中芳香化酶和StAR的影响

近年来，随着工农业的迅猛发展，大量污染环境和危害人类健康的化学污染物被不断地释放到环境中。其中酚类环境污染物及其衍生物化学性质稳定、难降解，易进入生物体内，干扰正常的生理活动，对动物的生殖内分泌系统产生不良影响。研究表明，双酚A(bisphenol-A ,BPA)可导致脊椎动物生殖功能下降，生殖异常和扰乱正常内分泌功能。同时，关于酚类物质干扰动物类固醇激素合成中的关键酶有很多报到，但是有关BPA对中国林蛙类固醇激素合成中芳香化酶和StAR的研究却很少。本实验以中国林蛙(Rana chensinensis)为研究对象,探讨BPA对中国林蛙精巢间质细胞中CYP19 mRNA、芳香化酶（P450arom）和StAR表达的影响, 旨在揭示酚类环境化学污染物影响两栖类动物内分泌的机制，为由BPA污染所造成的两栖类繁殖能力下降提供一定的理论依据。
本实验以雄性中国林蛙为实验动物，将中国林蛙暴露于10-7、10-6、10-5M BPA水体中持续10d、20d、30d；以10-8、10-9M 17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)作为阳性对照，取其精巢组织，用原位杂交方法检测CYP19 mRNA的表达，用免疫组织化学方法检测P450arom和StAR的表达。实验结果及结论如下：
1. 总RNA提取之后，测定RNA OD值，得到OD260/ OD280比值在1.9和2.2之间。经电泳检测，出现28S、18S、5S 三条带，说明样品纯度合格。成功扩增了322bpCYP19基因cDNA序列，经测序与美洲豹蛙(Rana pipiens)P450arom mRNA相似性为96%，与粗皮蛙(Rana rugosa )P450arom mRNA相似性为95%，初步确定所获序列为CYP19基因cDNA序列的一个片段。将该片段成功转化后提取质粒测序，结果确定插入片段为目的片段，将质粒线性化后，成功合成RNA探针。
2. 用合成的探针进行原位杂交反应，检测BPA、E2处理组和对照组中国林蛙精巢中CYP19 mRNA的表达，结果在间质细胞和支持细胞中均有CYP19 mRNA阳性反应，胞质内有蓝紫色颗粒。CYP19 mRNA阳性信号主要在间质细胞中表达，支持细胞中仅有少量表达。间质细胞中CYP19 mRNA的表达相对值统计分析结果可见，在10-5M、10-7M BPA处理组中，随BPA处理时间不同CYP19 mRNA表达相对值变化不显著。在10-6M BPA、10-8M E2浓度组中，随BPA、E2处理时间不同CYP19 mRNA表达相对值均高于对照组，其中当BPA、E2处理20d时，CYP19 mRNA表达相对值达到最大。在10-9M E2浓度组中，CYP19 mRNA表达相对值高于对照组，随E2处理时间的增加CYP19 mRNA表达相对值增加，CYP19 mRNA表达相对值随处理时间上调。在处理时间相同时, 当BPA浓度为10-6、10-7M， E2浓度为10-8、10-9M时CYP19 mRNA表达相对值随浓度增大而增加。表明间质细胞中CYP19 mRNA表达量与BPA的累积剂量有关，CYP19 mRNA分子表达量与BPA之间有剂量-时间效应关系。
3. 用免疫组织化学方法检测精巢中P450arom的表达，P450arom阳性反应主要在间质细胞。统计分析间质细胞中的P450arom的表达相对值，在10-5M、10-7M BPA处理组中，随BPA处理时间不同P450arom表达相对值变化不显著。在10-6M BPA、10-8M E2处理组中，随BPA、E2处理时间不同P450arom表达相对值均高于对照组，其中当BPA、E2处理20d时，P450arom表达相对值达到最大。在10-9M E2浓度组中，P450arom表达相对值高于对照组，随E2处理时间的增加P450arom表达相对值增加，P450arom表达相对值随处理时间上调。在处理时间相同时, 当BPA浓度为10-6、10-7M， E2浓度为10-8、10-9M时P450arom表达相对值随浓度增大而增加。表明间质细胞中P450arom表达量与BPA的累积剂量有关，P450arom蛋白表达量与BPA之间有剂量-时间效应关系。这些结果与CYP19 mRNA原位杂交结果基本一致。
4. 用免疫组织化学法检测精巢中StAR的表达，StAR阳性反应主要在间质细胞。统计分析间质细胞中的StAR的表达相对值，结果与P450arom免疫组织化学反应结果相似。但不同的是，在10-5M BPA处理组中，随BPA处理时间不同StAR表达相对值变化显著，其中，当BPA处理10d时StAR表达相对值较对照组降低，StAR表达下调。表明间质细胞中StAR表达量与BPA的剂量有关，StAR蛋白表达量与BPA之间同样有剂量-时间效应关系。
5. 本实验中E2作为BPA的一个阳性对照，处理结果显示，10-8M E2浓度组中，随E2处理时间不同CYP19 mRNA、P450arom、StAR表达相对值显著高于BPA处理组。显示雌激素活性E2> BPA。
上述结果表明，BPA能够影响中国林蛙精巢间质细胞中类固醇激素合成中的关键性酶P450arom、StAR的表达。提示BPA通过调控P450arom、StAR的表达来干扰动物的内分泌活动。