题目：ANXA2表达水平对人结直肠癌细胞增殖及运动影响的研究

结直肠癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，近年来由于人们生活方式的改变及膳食结构不合理，其发病率呈逐年上升趋势。目前手术仍是治疗结直肠癌最主要而有效的方法，但是5年生存率一直未有明显提高。随着分子生物学技术的发展，肿瘤的基因治疗给根除癌症带来了新的希望。
基因治疗的关键在于基因靶点的选择。与所有肿瘤一样，结直肠癌的发生也是一种多因素作用，多基因参与，多阶段形成的复杂病理过程。ANXA2是钙磷脂结合蛋白Annexin超家族的成员之一，该基因定位于人类染色体15q21-q22，由13个外显子和12个内含子组成，其表达产物ANXA2蛋白在细胞中以单体、异源二聚体、异源四聚体三种形式参与膜形成、膜转运、胞吞、胞吐、细胞增殖、信号转导、分化及凋亡等一系列重要的生命过程。近年来众多的研究已经证实ANXA2的表达失调与多种肿瘤的发生发展密切相关，其表达在人类绝大多数肿瘤中均上调，这种过表达现象与肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后差等密切相关。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来发现的一种重要的转录后基因沉默现象，具有高效性，高特异性等特点，目前已成为基因功能研究的强大工具并在肿瘤的研究及治疗方面具有广阔的应用前景。
本论文在综合国内外研究进展的基础上，采用RNA干扰技术，以质粒为载体构建靶向ANXA2的siRNA，并首次转染人结直肠癌细胞株Caco-2，观察抑制ANXA2的表达对Caco-2细胞生长特征的影响及其相关机制的初步探讨，为RNAi在结直肠癌的基因治疗中奠定基础。
目的：
研究siRNA介导的ANXA2基因沉默对人结直肠癌细胞Caco-2生物学行为的影响及其相关机制，探讨ANXA2在结直肠癌发生、发展中的作用，为以ANXA2为靶点的结直肠癌基因治疗提供理论和实验依据。
方法：
（1）针对ANXA2的ORF序列设计四条小干扰RNA序列和一条阴性对照序列，分别构建表达这四个序列和阴性对照序列的pU6H1-GFP-siANXA2重组质粒；
（2）通过脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000介导，将重组质粒导入人结直肠癌Caco-2细胞，同时设立阴性对照组和野生对照组。转染后24h荧光显微镜观察细胞的转染效率；48h
倒置显微镜观察细胞形态的变化；
（3）采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从mRNA水平检测重组质粒对细胞中ANXA2的抑制效果；
（4）采用细胞免疫化学和Western blot方法从蛋白水平检测转染后72h siRNA对ANXA2的抑制效果；
（5）采用MTT实验检测转染pU6H1-GFP-siANXA2重组质粒的Caco-2细胞活性，分别计算转染后24h、48h、72h、96h、120h细胞的生长抑制率, 观察重组质粒对Caco-2细胞生长增殖的影响；
（6）采用Hoechst 33258染色实验检测转染重组质粒的Caco-2细胞凋亡状况，于转染后48h、72h各组分别随机计数200个细胞，计算细胞凋亡率；
(7) 采用损伤修复实验检测抑制ANXA2表达对Caco-2细胞运动力的影响。
结果：
(1) DNA测序证实成功构建了针对ANXA2基因的siRNA重组质粒载体（pU6H1-GFP-siANXA2）；
（2）重组质粒作用Caco-2细胞48h后，形态学可见野生组Caco-2，细胞贴壁生长旺盛，边界清楚，呈上皮样细胞形态，可见较多的核分裂相，而转染pU6H1-GFP-si ANXA2的细胞形态发生明显改变，细胞贴壁能力下降、密度降低、细胞变小、变圆、颗粒增多、碎片增加、并有脂滴形成。阴性对照组细胞与野生型细胞形态上未见明显差别。转染效率约为40-50%；
（3）半定量RT-PCR检测结果显示所构建的4组重组质粒载体对人结直肠癌Caco-2细胞中ANXA2基因的表达均发挥了不同程度的干扰作用，其中以ANXA2-siRNA1载体的干扰效果最强，在转染后72h，抑制率高达70%；
（4）细胞免疫化学和Western blot检测结果也显示转染ANXA2-siRNA1重组质粒后72h的Caco-2细胞ANXA2蛋白水平显著下降，结果与RT-PCR基本吻合；
(5) MTT检测结果显示4组pU6H1-GFP-siANXA2重组质粒对Caco-2细胞的增殖均具有明显的抑制效应，从转染后48h开始细胞增殖受到抑制，72~120h时细胞增殖被极明显抑制 (p<0.01) ，最高抑制率达66%；
（6）Hoechst染色结果表明转染ANXA2-siRNA1后48h观察到具有典型凋亡特征的Caco-2细胞, 凋亡细胞占19.06±6.82%，作用72h后视野中凋亡的Caco-2细胞数量逐渐增多，凋亡细胞比例达25.57±5.56%，相同时间点转染组与对照组均具有极显著性差异（p<0.01）；
(7) 损伤修复实验结果表明pU6H1-GFP-siANXA2对Caco-2细胞的运动力具有明显的抑制作用，与阴性对照组（NT-siRNA），野生对照组相比，具有极显著性差异（p<0.01）。
结论：
ANXA2与人结直肠癌Caco-2细胞的生长、增殖、凋亡及运动力密切相关，抑制ANXA2的表达可抑制Caco-2细胞的增殖力和体外迁移能力，促进细胞凋亡。对ANXA2基因表达的干预作为一种新的基因治疗技术在结直肠癌治疗方面的应用潜力值得进一步研究，将给结直肠癌的治疗带来新的思路和策略。
 
关键词：膜联蛋白A2，结直肠癌细胞，细胞运动，细胞增殖，RNA干扰