题目：黏着斑激酶表达对人结直肠癌细胞行为影响的研究

摘 要

结直肠癌是严重威胁人类生存的常见消化道恶性肿瘤，近20年来，其发病率在世界大多国家呈逐年上升趋势。随着生活条件的改善、饮食西化，我国结直肠癌发病率上升趋势非常明显。肿瘤的发生涉及到原癌基因的激活和过表达、抑癌基因的突变或失活等复杂过程，人们一直试图把在肿瘤发生过程中发挥重要作用的基因作为靶点进行修饰或抑制以达到治疗目的。随着细胞及分子生物学的发展，与结直肠癌相关的基因治疗取得了较为明显的进展，许多新的靶点为结直肠癌发病机制的探讨、诊断及治疗提供了思路。RNAi是近几年发展的一种高效的基因沉默技术，在转录后水平抑制相应基因的表达。已有许多研究表明RNAi有很强的抑制目的基因的作用，比反义寡核苷酸抑制目的基因的效果及专一性更强。由于RNAi在研究基因沉默方面的广阔应用前景，尤其是在基因治疗、癌症研究、药物开发方面的巨大潜力，RNAi 已经作为一种关键技术应用于抗肿瘤研究。
本论文在综合国内外研究进展的基础上，应用针对FAK基因的siRNA质粒表达载体，作用于人结直肠癌Caco-2细胞株，利用RT-PCR、Western blotting、免疫细胞化学、Hoechst 33258染色、MTT法及损伤修复法等方法，研究其对FAK基因mRNA、蛋白表达水平变化、细胞凋亡形态学变化、增殖及迁移等方面的影响，取得了如下实验结果：
1. 设计了4条针对FAK基因的siRNA靶序列和一条错义对照序列，送交公司构建siRNA重组子。
2. 转染效率的优化：采用脂质体Lipofectamine 2000包裹重组质粒pU6H1-GFP-siFAK转染Caco-2细胞，研究了细胞接种密度、DNA用量、脂质体与DNA的比例、脂质体-DNA复合物的形成时间、细胞与脂质体复合物的孵育时间、血清的有无及细胞的传代次数等因素对脂质体转染效率的影响，结果表明2～5次细胞传代，每实验单位2×105接种密度、4 µg DNA用量、2.5：1 (V：W)的脂质体与DNA比例、30 min脂质体-DNA复合物形成时间以及6 h细胞与复合物孵育时间，转染效率最高。血清在本实验室条件下并不影响转染效率。
3. 对FAK基因表达的影响：应用RT-PCR、Western blotting及免疫细胞化学检测FAK mRNA和蛋白表达变化及时间效应，结果发现FAK siRNA导入Caco-2细胞后，FAK mRNA和蛋白表达水平明显下调，一定范围内呈时间依赖关系，FAK mRNA水平下调在转染后48 h达到最大，蛋白表达水平于转染后72 h达到最低，4个siFAK转染组均不同程度下调FAK 基因mRNA和蛋白水平的表达，其中以siFAK3和siFAK4干扰效果较为明显。同时免疫细胞化学检测结果也显示siFAK3、siFAK4转染Caco-2细胞48、72 h后FAK蛋白被明显抑制。
4. 对Caco-2细胞行为的影响：应用Hoechst 33258染色、MTT和损伤修复法检测Caco-2细胞在其FAK基因表达被有效敲低后细胞凋亡形态、增殖、迁移的变化，结果表明，经pU6H1-GFP-siFAK转染细胞后，细胞表现出典型的凋亡形态学变化，细胞增殖及迁移能力明显受抑，并呈时间依赖关系。