题目：丹参SmIS基因的克隆及功能初探

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一种重要的药用植物，以根及根茎入药，具有活血调经、祛癖生新、镇静安神、凉血消痈、消肿止痛等功效，被广泛应用于冠心病、脑血管病、肝炎、肝硬化、慢性肾衰竭、月经不调和心烦不眠等病症。以往对丹参的研究多集中在有效成分的药理作用及其生物合成途径上，然而对其功能基因的报道却较少。本文从丹参cDNA文库中筛选出一条胁迫相关基因SmIS，采用RT-PCR方法克隆得到该基因全长；利用DNA Walking的方法克隆获得其5’侧翼序列并对其调控信息进行了分析；采用实时定量PCR方法对该基因在不同器官、不同环境因子影响下的表达情况进行了分析；利用Over-expression和Knock-down等技术方法获得一系列SmIS基因表达上调的过表达植株和表达下调的干涉植株，进一步从形态、分子、生理等不同的水平将其与对照植株进行比较，初步探讨了该基因在丹参中的功能，为丹参功能基因组学的研究提供一定的资料。主要研究结果如下：
1.分别利用RT-PCR和PCR技术从丹参cDNA以及基因组DNA水平克隆得到了SmIS基因。该基因全长2565 bp，开放读码框516 bp，编码171个氨基酸。该基因包含6个外显子和5个内含子。SmIS在核酸水平和编码氨基酸水平仅与香橙(Citrus junos)和玉米(Zea mays)中铁盐胁迫相关基因有一定相似度，但其具体功能未见报道，属于功能未知的新基因。
2.生物信息学分析显示SmIS编码蛋白亲水性较强，具有10个磷酸化位点，可能含有叶绿体转运肽，不具跨膜结构域，二级结构主要由α-螺旋和不规则卷曲组成。
3.采用DNA-Walking的方法克隆得到1180 bp的SmIS 5’侧翼序列，分析发现其含有Box 4、CATT-motif、G Box、SP1、TCA-element、GT 1、W box、motif IIb、AuxRR-core、MBS、MYC、HSE、Skn-1_motif、ARE等顺式作用元件。推测，SmIS的表达可能受到光、高温、病原菌浸染、干旱、损伤、植物激素(生长素、SA、ABA)等因子的调控，参与丹参某些重要的生理过程。
4.基因表达分析显示，SmIS主要在叶中特异表达；脱落酸(100 µM ABA)和干旱条件在一定时间范围内均可诱导该基因的表达上调，而水杨酸(5 mM SA)和创伤处理对该基因的表达起负调控作用。
5.利用PCR方法检测转基因植株，获得了12株阳性过表达植株和10株阳性RNAi植株，转化效率分别为33.3%和30.3%。进一步对转化植株进行表达分析，结果显示RNAi植株中SmIS的表达量均有不同程度的下调，而过表达株系中只有部分表现出表达上调。
6.在正常培养条件下，获得的阳性过表达及RNAi植株在表型上与对照植株无显著差别。在缺铁的1/2 MS培养基上，RNAi植株不同于过表达和对照株系，出现不生根的现象；而在添加0.2 mg/L的吲哚丁酸(IBA)的缺铁1/2 MS培养基中，RNAi株系同过表达和对照株系均可以生根；实时定量PCR方法检测显示，丹参幼苗在缺铁情况下，SmIS基因表达上调，因此推测SmIS基因对丹参的生根过程有一定的调节作用。
7.抗性检测结果显示，缺铁培养条件下，膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)的含量在过表达、对照以及RNAi植株中无明显差异，表明在丹参中过表达SmIS基因并不能提高植株的抗缺铁胁迫的能力，该基因不是参与缺铁胁迫的的抗性基因。