题目：丹参普遍胁迫蛋白基因（SmUSP1）克隆及其功能的初步研究

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，生态适应性强，是一个从热带到寒带广泛分布的具有普遍逆境耐受性的草本植物。同时丹参也是一种重要的药用植物，其干燥根及根茎入药，具有活血通络、祛淤止痛、凉血消痈、清心除烦等功效。随着对丹参的主要化学成分及药理作用的研究，丹参资源的开发和利用也有了较大的发展，其需求量不断扩大。同时，丹参野生资源匮乏，栽培品种品质良莠不齐，病虫害逐年加重。因此，利用生物技术手段创造丹参优良种质具有重要的意义。丹参功能基因组学的研究已经逐步展开，寻找与抗逆相关的基因、了解其抗逆机制，通过基因工程提高丹参抗逆性能是实现这一目标的重要途径之一。
本研究在对丹参EST数据库分析的基础上获得一个普遍胁迫蛋白(Universal stress protein,USP)基因序列，通过对其进行基因克隆、表达模式研究来了解该基因的基本特征。利用转基因和RNAi技术就该基因对丹参生长发育及抗逆性的影响进行了初步研究，为阐明普遍胁迫蛋白基因在丹参中的功能提供资料，同时也为进一步通过分子生物学技术和基因工程手段提高丹参抗逆性能奠定基础。论文主要研究内容及结果如下：
1. 通过对丹参EST数据库的分析，电子克隆得到一个580 bp具有完整开放读码框的Unigene，编码一个由177个氨基酸残基组成的多肽。经Blast分析发现所得的基因片段与其它物种中的USP基因有很高的相似度，且蛋白结构域分析在其第43～165个氨基酸残基之间是普遍胁迫蛋白A亚家族的保守结构域，故将其命名为SmUSP1。
2. 利用RT-PCR和PCR的方法分别从丹参cDNA和gDNA水平克隆得到了SmUSP1基因的全长，该基因DNA水平全长1537 bp，由5个外显子和4个内含子组成，内含子两端具有GT/AG保守序列。生物信息学分析结果表明：SmUSP1的分子量为19.62 kD，理论等电点为5.948，是一个不具有跨膜结构域和信号肽的亲水性细胞质蛋白，二级结构以α-螺旋为主。
3. 采用DNA Walking的方法克隆得到了约1700 bp的SmUSP1 5’侧翼序列。顺式作用元件分析的结果显示，该启动子区域上分布有与生物或非生物胁迫相关的顺式作用元件如MYB、MYC、W box、I box等，以及与激素响应相关的顺式作用元件ABRE、GARE-motif、GT1等。在此基础上，利用实时荧光定量PCR技术对SmUSP1基因的表达模式进行了研究。SmUSP1基因在丹参的根、茎和叶中均有表达，其中叶中的表达丰度远高于根和茎中。干旱、100 µM ABA、5 mM SA和创伤处理都能够诱导SmUSP1表达的上调。
4. 丹参SmUSP1基因启动子-GUS报告基因融合载体转化丹参的结果显示，SmUSP1基因5’侧翼区在丹参叶片中具有启动子的活性，且该活性受到ABA和高温的诱导，表明丹参SmUSP1基因启动子是一个诱导型启动子。
5. 通过转基因技术和RNAi技术，获得了SmUSP1基因在丹参中的过表达和RNAi植株。抗性检测表明过表达和RNAi株系在正常培养条件下与对照植株相比无表型上的差异。在添加一定浓度的NaCl和甘露醇的培养基上，过表达植株表现出比对照及RNAi植株较快的根伸长速度，且膜脂过氧化产物丙二醛的产生也较慢。植株脱水率实验显示，当暴露于空气中时，过表达株系脱水速率比对照和RNAi株系植株慢。这些结果说明SmUSP1基因可能参与了植株抵御外界不良环境的过程。