题目：磁场联合抗肿瘤药物对肿瘤细胞杀伤机制的研究

目的：
研究磁场（static magnetic field, SMF）结合抗肿瘤药物对人源肿瘤细胞K562细胞以及SW480细胞协同杀伤的细胞生物学机制。
方法：
1. 采用MTT法检测SMF和ADM单独及联合作用下，对K562细胞生长活性的影响；以及SMF和顺铂单独及联合作用下，对SW480细胞生长活性的影响。
2. 通过单细胞凝胶电泳、流式细胞术，检测SMF联合不同种类的抗肿瘤药物对细胞周期时相分布和细胞DNA损伤的影响。
3. 用HE染色、原子力显微镜、透射电镜、免疫荧光等手段，检测SMF联合抗肿瘤药物对K562细胞和SW480细胞的显微结构、超微结构、P-gp表达的的影响。
结果：
1.（1）阿霉素和顺铂分别对K562细胞和SW480都有明显的时间与浓度依赖关系（或称量效作用）。随药物浓度增加，细胞生长活性也明显下降。（2）K562细胞经35ng/mL阿霉素单独处理12h即可引起细胞生长抑制（p<0.05）。（3）SW480 细胞经2μg/mL顺铂单独处理12h可引起细胞生长抑制（p<0.05）。
2.（1）K562细胞在25ng/mL阿霉素和SMF单独作用12h时均未表现出杀伤效应；25ng/mL阿霉素和SMF联合作用时，与对照组、阿霉素单独处理组相比细胞活性显著降低（p<0.05）；（2）SW480细胞经1μg/mL顺铂或磁场单独处理12h后，均未表现出杀伤效应；而当1μg/mL顺铂与SMF联合作用12h时，细胞活性显著低于对照组（p<0.05），且与顺铂单独处理组之间也有极显著差异（p<0.01）。
3.（1）K562细胞经SMF处理12h后，G2/M期细胞的比例明显增加，显示SMF可将细胞阻滞于G2/M期。ADM单独处理K562细胞后，G1期细胞减少，S期和G2/M期细胞比例较对照相比略有增加。SMF与ADM共同作用后，可将细胞阻止于G2/M期。（2）以尾长和尾部DNA含量为DNA损伤参数的彗星电泳检测，发现K562细胞经SMF处理后细胞DNA没有损伤（p>0.05）；ADM可对细胞DNA形成明显损伤（p<0.05）；磁场与ADM联合处理后，细胞DNA的损伤与ADM组之间有极显著差异（p<0.01），表明磁场促进了ADM对细胞DNA的损伤。（3）人淋巴细胞经SMF与ADM单独或联合处理后，细胞DNA未出现损伤（p>0.05）；表明人淋巴细胞对药物和SMF的联合及单独处理的耐受性显著高于K562细胞。
4. （1）SW480细胞曝磁后G2/M期细胞比例略有增加。顺铂作用后SW480细胞G1期比例略有增加，各周期时相的细胞比例与对照相比差异不明显，表明顺铂对SW480细胞周期分布的影响有限。顺铂与磁场共处理细胞后，G1期细胞的比例明显增高，表明磁场与顺铂联合作用时细胞可被阻滞于G1期。（2）SW480经顺铂和/或磁场处理后，彗星电泳检测发现，以尾长、尾部DNA含量、头部DNA含量和头部区域为DNA损伤参数，仅在DNA头部区域这一参数下发现顺铂、顺铂结合磁场会致使细胞DNA头部区域变小，与对照相比差异极显著（p<0.01）。
5. （1）HE染色后光镜观察的结果发现，曝磁后部分K562细胞的细胞核染色略深，阿霉素处理后细胞核深染，细胞表面变得粗糙，有损伤细胞出现；SMF联合阿霉素处理后，细胞周边出现小泡，部分细胞破损，视野中可见细胞碎片，并出现较大细胞。
（2）原子力显微镜观察K562细胞表面的精细结构，发现曝磁后细胞表面出现凹陷。经阿霉素处理的细胞表面出现均匀的粒状突起物，并出现一些形状不规则的凹陷。SMF结合阿霉素处理K562细胞后，细胞表面出现凹陷，并可观测到不规则的突起物。实验结果显示，SMF可协同阿霉素增强对K562细胞表面结构的破坏。
（3）透射电镜观察K562细胞分别经阿霉素及SMF处理后超微结构的变化。SMF处理后细胞胞浆内线粒体、内质网和溶酶体等胞内结构增多，细胞表面出现微小凹陷。阿霉素处理后细胞胞浆内溶酶体增多，胞内出现较多的空泡，胞膜处有明显的凹陷和突起产生。SMF与ADM联合处理后细胞表面的凹陷与突起均增多，胞内出现较大的空泡，线粒体结构破坏，核膜内褶卷曲。实验观察表明SMF与阿霉素共作用对细胞表面和内部超微结构有协同损伤效应。
（4）流式细胞仪观察免疫荧光染色后K562细胞在SMF与阿霉素单独以及联合处理后，细胞内P-gp表达的变化。实验显示，阿霉素可诱导P-gp的表达。SMF可阻止K562细胞的P-gp表达。SMF与阿霉素联合作用亦可降低细胞P-gp的表达。实验结果提示，SMF与阿霉素对K562细胞的协同杀伤与胞内阿霉素含量相关；SMF对P-gp表达的下调可能造成胞内药物含量的升高。
（5）AFM观察了SW480细胞经SMF以及顺铂处理后表面形貌的变化。对照细胞表面比较平滑。经SMF处理后细胞表面出现凹陷与皱褶。经顺铂处理后，细胞表面出现均匀的粒状突起物和微小凹陷。SMF结合顺铂处理SW480细胞后，细胞表面出现突起和不规则的凹陷。实验结果提示，SMF可协同顺铂增强对细胞表面结构的破坏。
（6）荧光显微镜观察SW480细胞经SMF以及顺铂处理后，FITC-鬼笔环肽标记的细胞F-actin的变化。实验显示SMF导致细胞内F-actin弥散分布，表明F-actin的分布紊乱；顺铂处理后，细胞膜表面出现类似延展过程的棘状突出，胞内F-actin排布紊乱。SMF与顺铂联合作用导致SW480细胞胞内F-actin解聚，荧光信号减弱；胞内荧光信号弥散状分布提示细胞内微丝排列紊乱。
结论：
（1）磁场结合阿霉素在一定条件下对K562细胞有协同杀伤效应，磁场结合顺铂在一定条件下对SW480细胞有协同杀伤效应。
（2）通过对细胞周期分布、细胞DNA损伤及细胞形态的检测发现：K562细胞在SMF与阿霉素协同作用下的生物学效应主要有：细胞内部结构和细胞膜受损、细胞周期分布改变与细胞DNA损伤。其协同机制可能涉及细胞内药物的含量，SMF能够下调多药耐药蛋白P-gp的表达，而阿霉素能上调P-gp的表达。
（3）SW480细胞经顺铂和SMF联合处理，造成细胞内部结构与细胞膜受损、细胞周期分布改变与细胞骨架结构（微丝）的破坏。实验发现，与K562细胞不同，顺铂协同SMF杀伤SW480细胞的机制涉及细胞的粘附功能。顺铂与SMF联合作用阻碍了F-actin的形成，使细胞无法粘附于生长基底，致使生长信号缺失，细胞无法进入增殖周期，导致细胞的G1期阻滞。