题目：不同强度聚焦超声结合原卟啉对离体培养S180肿瘤细胞的损伤作用研究

声动力学疗法（Sonodynamic therapy，SDT）是在光动力学疗法的基础上建立和发展起来的，是由日本学者Umemura等1989年提出的抗癌新思路和新方法，即利用超声激活富集且能长时间潴留于肿瘤细胞内的血卟啉及其衍生物杀伤癌细胞的方法。该疗法具有较强的针对性和对正常组织的无创伤性，且弥补了光动力学疗法只能治疗浅表组织的局限性，因而对于治疗肿瘤，特别是组织深层肿瘤有着较好的应用前景。原卟啉Ⅸ (Protoporphyrin Ⅸ，PpⅨ) 是血卟啉衍生物的一种有效成分，本室前期的研究表明PpⅨ比血卟啉更利于对细胞产生毒性作用。PpⅨ在肿瘤组织或细胞中的聚集可以通过直接向体系中加入PpⅨ或5-ALA的方式来实现。目前由5-ALA诱导产生内源性光敏剂PpⅨ的研究在光动力学疗法中已经发展成熟，但其在声动力学疗法的研究中报道较少，且超声激活外源性PpⅨ的抗肿瘤研究也还处于初级阶段。
本论文以国家自然科学基金项目“超声激活血卟啉抗肿瘤细胞的分子生物学机制”和“超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制的研究”为依托，采用频率为1.065 MHz的聚焦超声结合内、外源PpⅨ对离体培养的S180肿瘤细胞的损伤作用进行研究，目前取得的实验结果如下：
1. 测得实验所用原卟啉Ⅸ的最大荧光激发波长为408 nm，最大荧光发射波长为605 nm，通过荧光分光光度法检测了外源性PpⅨ和内源性PpⅨ在S180肿瘤细胞中的代谢。研究发现，在加入外源性PpⅨ后45-120 min，细胞对PpⅨ的吸收基本达到相对饱和状态；而5-ALA诱导S180肿瘤细胞代谢生成的内源性PpⅨ在0～12 h内随时间的延长几乎呈线性增加；高效液相色谱分析显示5-ALA在S180肿瘤细胞内的富集产物主要是PpⅨ，而非代谢过程中的其他产物，且其含量随时间延长的变化与荧光光度法分析结果一致。
2. 内、外源性PpⅨ在S180肿瘤细胞中的亚细胞定位及其动态变化的研究发现，两者的亚细胞定位均存在时间依赖效应；部分外源性PpⅨ主要分布于细胞膜，细胞质内也有红色荧光，而5-ALA诱导细胞生成的内源性PpⅨ则主要定位于线粒体。
3. 在外源性PpⅨ和1 mM5-ALA孵育12 h所生成的内源性PpⅨ含量相同的条件下，分别经强度为0、1、3、5 W/cm2的超声处理30 s后，台盼蓝拒染检测发现超声结合内源性PpⅨ组和超声结合外源性PpⅨ组细胞的存活率与单纯超声组相比没有明显差异。当外源性PpⅨ浓度增大至40 μM时，超声结合PpⅨ协同杀伤细胞的效应较单纯超声组差异极显著（P<0.01）。
4. 扫描电镜和透射电镜的形态学观察发现原卟啉Ⅸ-声动力学疗法对S180细胞膜产生损伤效应，表现为随超声强度加大，超声结合PpⅨ处理组细胞严重变形，膜表面微绒毛消失，形成指状突起，胞膜破裂，胞质流失等；乳酸脱氢酶释放实验和丙二醛、ATPase活性检测实验表明，不同处理后S180肿瘤细胞膜完整性和通透性发生不同程度的改变，膜脂质过氧化水平升高，ATP酶活性下降等。由此可推测细胞膜等膜性结构是超声激活外源性原卟啉Ⅸ作用于S180肿瘤细胞的一个主要靶位点，超声结合原卟啉Ⅸ处理可直接或间接破坏离体培养S180肿瘤细胞的膜系统。