题目：rhG-CSF动员和骨骼肌电刺激促进大鼠骨折愈合及其可能机制探讨

目的：在骨科领域，如何加快骨折愈合、治疗骨不连和骨折的延迟愈合是该领域的热点问题，本文研究目的旨在探讨经皮骨骼肌电刺激联合干细胞动员对大鼠骨折愈合过程中骨重建及细胞增殖的影响及其可能机制。
方法：选取3月龄大鼠（由西安交通大学实验动物管理中心提供）80只，体重180g～220g。随机分为4组，每组20只：骨折模型组（A组）；模型+动员剂组（B组）；模型+电刺激组（C组）；模型+动员剂+电刺激组（D组）。各组均采用国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食。用自制造模支架建立大鼠胫骨闭合性骨折模型，刺激模型参照吕晓宇和彭亮刺激模式相结合并略加改动建立大鼠的电刺激模型。骨折后分2周、4周、6周和8周取材，制成不脱钙硬组织切片和脱钙骨切片，运用四环素和茜素红双荧光标记、特殊染色、免疫组织化学SABC法检测骨组织在骨折愈合过程中结构的变化、钙的沉积、成骨情况及细胞因子和细胞增殖相关蛋白的表达。
结果：
1 用大鼠闭合性骨折造模支架造成大鼠胫骨中段骨折，经X光片判断，成功建立了大鼠胫骨中段闭合性骨折模型。
2 rhG-CSF和（或）骨骼肌电刺激可促进大鼠骨折愈合后的功能恢复。骨折后单纯rhG-CSF作用和单纯骨骼肌电刺激以及rhG-CSF联合骨骼肌电刺激作用均可促进骨折愈合后的功能恢复，而rhG-CSF联合骨骼肌电刺激促进大鼠骨折愈合后的功能恢复效果最显著。
3 rhG-CSF和（或）骨骼肌电刺激可使大鼠骨折愈合后软骨骨痂数量增多，骨组织钙化发生较早，骨折愈合程度较好，尤其以电刺激组和电刺激+动员剂组效果更明显。提示，骨折后进行骨骼肌电刺激协同骨髓干细胞动员，可以增加骨折愈合早期的软骨细胞数量促进软骨内成骨，加速骨折愈合。
4 单纯rhG-CSF动员和单纯电刺激均可使患肢骨2次标记线间距随愈合时间延长而逐渐增加，和模型组相比较显著性升高，单位面积相对荧光强度结果显示，单纯干预组可影响骨折愈合进程中钙盐的沉积，促进骨基质钙化。
5 rhG-CSF动员和骨骼肌电刺激联合作用可使患肢骨2次标记线间距逐渐增大，在造模后第6周达到峰值。提示在骨折中后期钙盐沉积量最大；与单纯干预组比较患肢骨2次标记线间距显著性增大，表明联合干预比单纯干预更有助于骨折愈合。
6 rhG-CSF动员和骨骼肌电刺激对骨折大鼠骨组织细胞生长因子表达产生影响。骨折愈合初期软骨和骨细胞bFGF和c-kit显著性升高；单纯电刺激和电刺激联合动员干预，可促进软骨和骨细胞的c-kit表达在第4周达到峰值，而单纯动员剂组在第6周到峰值；各组TGF-β1和bFGF均在第6周阳性表达达到峰值；在骨折愈合后期各细胞因子表达均有所下降，但仍高于对照组。表明单纯刺激和联合刺激方式均可不同程度促进骨诱导因子的表达，促进骨折愈合。
7 rhG-CSF动员和骨骼肌电刺激对骨折大鼠骨组织增殖相关蛋白表达产生影响。电刺激和动员剂联合作用后，PCNA、BrdU和ki-67在骨折愈合过程中表达逐渐升高，表明细胞增殖相关蛋白在骨折愈合各时期均有表达，但在不同时期表达细胞的种类不同，早期主要是分裂期的间充质干细胞及软骨细胞，后期是成骨细胞。在rhG-CSF作用的大鼠骨折愈合早期BrdU阳性表达并不显著，后期有所升高，PCNA和ki-67则持续高表达；单纯电刺激组细胞增殖相关蛋白的表达也随骨折愈合表达逐渐升高，尤其BrdU表达升高具有极显著性差异。表明，单纯电刺激与单纯干细胞动员相比更有利于骨髓干细胞的增殖及分化。二者联合作用后PCNA、BrdU和ki-67表达峰值出现在第6周，提示双重促进作用使细胞增殖数量增加，且处于有丝分裂期的细胞数量较多，有利于骨组织的重建。
结论：
骨骼肌电刺激改善骨折处周围的力学环境，在骨折部位形成微动效应，为成骨作用提供力学条件，可使大鼠骨折愈合后软骨骨痂数量增多，骨组织钙化发生较早，患肢骨2次标记线间距随愈合时间延长而逐渐增加，骨折愈合程度较好，促进骨折愈合后的功能恢复。在此过程中，TGF-β1、PCNA和BrdU表达显著性升高，电刺激促进局部细胞因子的分泌和释放，加速骨折愈合。因此，采用早期微动方式的骨折愈合效果优于传统的石膏夹板绝对固定方式。
rhG-CSF动员自体骨髓干细胞，促进骨髓间充质干细胞和造血干细胞的释放并向骨折部位迁移，增加干细胞向成骨、成软骨方向的分化，促进软骨内成骨、骨基质钙化和骨折部位血管新生，加速骨折愈合，促进大鼠骨折愈合后的功能恢复。在此过程中，骨折愈合初期软骨和骨细胞TGF-β1、bFGF、PCNA、BrdU和ki-67在第6周达到峰值；在骨折愈合后期各细胞因子表达均有所下降，但仍高于对照组。因此，采用早期自体骨髓干细胞动员方式促进骨折愈合的效果优于传统的石膏夹板绝对固定方式。
rhG-CSF动员和骨骼肌电刺激联合作用后，既可促进骨髓间充质干细胞和造血干细胞的释放并向骨折部位迁移，增加干细胞向成骨、成软骨方向的分化，又保证了骨生长所需要的力学环境，改善局部的血液循环，加快骨改建进程；二者均可加强骨诱导因子和细胞增殖相关蛋白的表达，进而缩短骨折愈合时间。因此，骨骼肌电刺激引起的微动效应和干细胞动员促进骨折愈合的效果优于单纯骨骼肌电刺激、rhG-CSF动员和传统的石膏夹板绝对固定等方式。