题目：茶多酚与溶菌酶纤维对人红细胞的作用研究

茶多酚是茶叶中儿茶素类、黄酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称, 是茶叶中的主要生物活性成分，约占茶叶干重的30%～42%。茶多酚中最重要的成分是黄烷醇类的多种儿茶素，其中含量最多的是EGCG，约占茶多酚的50%～75%。这些具有多酚结构的物质由于其抗氧化活性，被证实对人体健康具有多方面的有益作用。另一方面，由于茶多酚在分解代谢的过程中可能涉及自由基中间体，能够诱发活性氧生成，可以直接或者间接产生促氧化作用，对生物分子和组织造成损害。因此，茶多酚既有抗氧化作用，也有促氧化作用，即所谓的双重作用。本文利用人红细胞作为实验模型，研究了在无外加胁迫时和在溶菌酶纤维存在时五种茶多酚（EGCG[1]、ECG[2]、EGC[3]、EC[4]和C[5]）与红细胞的相互作用。实验结果表明，五种茶多酚中EGCG和EGC对红细胞有明显的作用。当无外加胁迫时，EGCG和EGC对红细胞有促氧化作用，促氧化作用主要表现为诱导红细胞形变、醌类蛋白质形成和减少膜GSH含量水平等，导致红细胞膜的磷脂脂肪酸氧化，膜骨架蛋白聚集等，其作用大小与浓度和作用时间呈正相关。EGCG对红细胞膜的促氧化机制与对苯醌的相似。当有溶菌酶纤维存在时，EGCG和EGC对溶菌酶产生的细胞毒性有抗氧化作用。
实验的主要方法和结论：
一、茶多酚对溶菌酶纤维产生的细胞毒性的影响
1. 溶菌酶纤维与红细胞膜的相互作用
提取红细胞膜分别与溶菌酶蛋白和溶菌酶纤维相互作用，用SDS-PAGE检测红细胞膜蛋白谱带。发现溶菌酶蛋白与红细胞膜骨架蛋白无作用，溶菌酶蛋白经孵育成为溶菌酶纤维后与膜蛋白作用，导致了膜骨架蛋白聚集，且膜骨架蛋白聚集量与溶菌酶纤维孵育时间成正比。结果表明，溶菌酶蛋白对血红细胞无毒性作用，溶菌酶纤维对血红细胞有毒性作用。
2．EGCG对溶菌酶纤维所致的红细胞膜蛋白损伤的影响
将EGCG，溶菌酶纤维和红细胞进行相互作用，用SDS-PAGE检测红细胞膜蛋白谱带。发现溶菌酶纤维对红细胞膜骨架蛋白有损伤作用，导致膜骨架蛋白聚集。EGCG对溶菌酶纤维所致的红细胞膜骨架蛋白的损伤有一定得减缓作用。得出EGCG对溶菌酶纤维所致的红细胞膜蛋白损伤具有抗氧化作用。
3. 茶多酚对溶菌酶纤维所致的红细胞形态变化的影响
红细胞经过溶菌酶纤维处理后，通过扫描电镜观察可见红细胞发生了轻度聚集，在红细胞周围出现小的膜泡，还有小部分细胞发生形变，边缘出现棘突。认为这些小的膜泡是红细胞在溶菌酶纤维作用下膜溢出或破损部分再次聚集而成。EGCG和EGC对溶菌酶纤维所致的红细胞聚集有所减缓，红细胞周围不再产生小的膜泡。
二、  茶多酚与红细胞膜的相互作用
1．茶多酚对红细胞膜蛋白谱带的影响
提取红细胞膜与茶多酚相互作用，用SDS-PAGE检测红细胞膜蛋白谱带。发现EGCG和EGC诱导红细胞膜骨架蛋白聚集，VC将EGCG和EGC诱导的红细胞膜骨架蛋白聚集完全还原。这种自由基清除剂VC对红细胞膜骨架蛋白聚集的还原现象，说明EGCG和EGC的促氧化作用是通过诱导产生自由基而实现的。通过进一步的研究浓度对EGCG和EGC的促氧化活性的影响，发现EGCG和EGC的促氧化活性均具有浓度依赖性。以EGCG来说，浓度1 μg/ml以下对膜蛋白几乎没有作用，浓度1 μg/ml以上其氧化活性与浓度呈正相关，可见，高浓度有利于茶多酚发生促氧化作用。
2．茶多酚对红细胞膜GSH含量的影响
GSH含量的增减可间接反映细胞氧化胁迫情况。采用Ellman方法测定红细胞膜GSH含量。发现茶多酚可使红细胞膜GSH含量降低，顺序为EGCG>EGC»ECG≈EC≈C。认为本实验过程中GSH含量降低的原因是：EGCG和EGC的促氧化过程中诱发自由基的产生所致。
3．茶多酚多红细胞膜脂质的影响
膜磷脂的组成及含量变化可反映细胞膜的结构和功能的改变。通过HPLC分析红细胞膜磷脂，在经EGCG作用后，红细胞膜中主要的三种磷脂（PC，PE和PS）分析值降低， 反映了膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的含量减少，认为这是由EGCG促氧化过程中产生的自由基与其发生氧化反应，导致红细胞膜磷脂脂肪酸氧化所致。PE，PC和PS含量随着EGCG浓度的增加而减少。
4．茶多酚对红细胞的形态影响
用五种茶多酚（EGCG、ECG、EGC、EC和C）处理红细胞，镜下观察可见ECG、EC和C作用很小，红细胞没有发生聚集，细胞大体没有发生形变，只有微量细胞发生形变，边缘出现棘突；EGCG和EGC处理的红细胞发生了轻度聚集，有部分细胞发生形变，边缘出现棘突。认为是由于EGCG和EGC诱发产生自由基导致红细胞变形性下降以及红细胞膜结构改变影响红细胞变形性所导致。
5 对苯醌和EGCG对红细胞膜作用的比较
用SDS-PAGE检测红细胞膜蛋白谱带，发现EGCG和对苯醌均诱导膜蛋白聚集体形成，这些高分子聚集体主要来源于血影蛋白，锚蛋白，带3蛋白，带4.2蛋白和肌动蛋白，且均可被VC还原，说明EGCG和对苯醌对红细胞膜蛋白的作用相似；采用Ellman方法测定红细胞膜GSH含量，发现EGCG和对苯醌均可使红细胞膜GSH含量降低，且GSH含量降低程度与EGCG和对苯醌的浓度成正比，说明EGCG和对苯醌对红细胞膜GSH含量的影响相似；通过HPLC分析红细胞膜磷脂，经EGCG和对苯醌作用后，均诱导红细胞膜中主要的三种磷脂： PC，PE和PS分析值降低，说明EGCG和对苯醌均导致红细胞膜的磷脂脂肪酸氧化，它们对红细胞膜脂质的作用相似。因此，EGCG对红细胞膜的作用相似于对苯醌，有力的证明了EGCG对红细胞膜有促氧化作用，并且在该过程中有醌类蛋白质和半醌自由基生成。
6．五种茶多酚对红细胞的不同作用
通过上述结果发现，五种茶多酚（EGCG、ECG、EGC、EC和C）对红细胞具有不同的作用，ECG、EC和C对红细胞几乎没有作用，EGCG和EGC对红细胞有促氧化作用。这种茶多酚氧化能力的差异性应归结于茶多酚的结构差异。