题目：绞股蓝多糖的提取分离、结构分析及生物活性研究

摘 要:过度的运动训练会导致运动员机体内源性氧自由基生成增多，过多的自由基会氧化损伤机体的组织细胞，导致运动员的运动能力下降，机体产生运动疲劳；同时，过度运动训练还会导致运动员的机体在运动后一段时间内出现免疫抑制现象，机体在此时期易感染疾病，进而影响运动员的运动能力和健康。许多研究表明，通过服用中草药补剂，能够保护运动员身体健康以及提高其运动能力。因此，提取、分离、筛选中草药中的活性成分以及进一步深入研究这些活性成分的结构组成、分子形貌等是目前国内外运动医学与运动生物学研究领域的重要问题，这些研究成果将在运动医学、运动生物学研究领域具有重要的理论意义和应用价值。草质藤本植物绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino)已经被人们证实具有众多生物活性，皂甙被认为是它的主要活性成分，并且已经被开发与应用，取得了良好的社会效应。目前，一些实验研究表明，绞股蓝粗多糖也显示出一定的延缓机体衰老、增强机体耐力、提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性，这些研究结果提示：绞股蓝粗多糖可能含有保护运动员身体健康和提高运动能力的高活性组分。如何筛选这种活性组分？其分子结构是什么？它在体内的作用机制是什么？等等，这些都是本文需要解决的问题。上述问题在国内外文献中鲜有报道，因此，本文以安康地区平利县人工栽培绞股蓝为原料，对其多糖成分进行了研究，主要结论如下：
1. 热水浸提法提取绞股蓝粗多糖，最佳提取工艺为：提取温度90 ℃、料液比1:15、提取时间120 min，提取两次后绞股蓝粗多糖提取率为3.43 %。微波辅助提取法提取绞股蓝粗多糖，最佳提取工艺为：微波功率300 W、作用时间25 min、料液比1:20，提取两次后绞股蓝粗多糖提取率为3.94 %，较热水浸提法，绞股蓝粗多糖提取率增加0.51 %，单次提取时间缩短了95 min。
2. 采用分级沉淀法、DEAE-纤维素柱层析、SephadexG-150柱层析对绞股蓝多糖（GPP）进行逐步分级。采用比旋光度法和凝胶柱层析法对得到的多糖组分进行纯度鉴定。利用气相色谱法对各多糖组分进行单糖的组成分析。采用紫外图谱检测多糖组分是否含有蛋白质、核酸和多肽。采用红外图谱检测多糖组分的官能团和糖苷键构成。结果如下：通过逐步分级，得到了四种多糖组分（依次命名为：GPPⅡ-a、GPPⅡ-b、GPPⅢ-a和GPPⅢ-b）；纯度鉴定表明，该四种多糖组分为均一多糖；气相色谱法表明，该四种多糖组分的单糖组成分别是：GPPⅡ-a由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖组成（摩尔比为0.18:0.72:1.00）；GPPⅡ-b由阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖组成（摩尔比为0.38:0.64:0.97:1.26:1.00）；GPPⅢ-a由核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖组成（摩尔比为0.83:0.75:1.21:1.00）；GPPⅢ-b由核糖、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖组成（摩尔比为1.62:0.54:0.49:1.00）；紫外图谱(UV)分析结果表明，GPPⅡ-a、GPPⅡ-b、GPPⅢ-a和GPPⅢ-b均不含蛋白质和核酸；红外图谱(IR)分析结果表明：GPPⅡ-a含有大量的α-糖苷键和少量的β-糖苷键；GPPⅢ-a是含有α-糖苷键的化合物，GPPⅡ-b和GPPⅢ-b是含有β糖苷键的化合物；基本理化性质如下：GPPⅡ-a为白色粉末，GPPⅡ-b为黄色粉末、GPPⅢ-a为灰白色粉末、GPPⅢ-b为淡黄色粉末，GPPⅡ-a和GPPⅢ-a吸湿性强，四种多糖均能溶于水和二甲亚砜，尤其溶于热水，均难溶于高浓度的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇、氯仿等有机溶剂；四种多糖为非淀粉多糖，不含游离单糖、多酚类物质、糖醛酸、氨基酸或蛋白质等物质。
3. 对GPP以及GPPⅡ-a、GPPⅡ-b、GPPⅢ-a、GPPⅢ-b体外对O2-. 和OH . 的清除效果、对卵黄LDL过氧化反应的抑制效果、体外对小鼠脾细胞的增殖作用等方面进行了对比，同时对这几种多糖对疲劳运动小鼠的力竭时间进行了对比，结果显示：GPP和GPPⅡ-a在这几个方面的活性都较比较明显，在四个组分中， GPPⅡ-a显示出更强的活性，是GPP的主要活性组分。
4. 采用原子力显微镜（AFM）和环境扫描电镜（SEM）对GPPⅡ-a的分子形貌进行了观测，AFM的结果证实GPPⅡ-a分子在溶液中呈直径大小不一的不规则“环”状聚集体，“环”的侧枝呈现直径大小不一的“棒”状或“环”状聚集体；SEM的结果显示GPPⅡ-a在固态下呈相互连接的“球”状聚集体。小球表面有许多紧密的网状结构，GPPⅡ-a的分子间相互作用较强，结合紧密，在固态下具有高度聚合性。结合其AFM和SEM的结果分析，这些“球”状或“环”状的结构可能借助于糖链及其分支较多的氢键或其他弱作用力而连接或聚集，组装成链状或网状结构，链的形状可能与温度等外界因素有关。热分析结果表明，在加热过程中，GPPⅡ-a有两次较大的质量损失过程，出现1次放热峰和1次吸热峰。
5. 采用凝胶柱层析法，测定GPPⅡ-a的分子量为8.92×104 Dal；根据部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析和核磁共振结果分析，推断GPPⅡ-a分子的主要重复结构单元大概由19个糖残基组成，主链由α-Glc(1→4)组成，在O-6处有分支，平均每3个已糖残基有1个分支残基； GPPⅡ-a的侧链有三种：一个是2个(1→6)Glc，一个是2个(1→3)Gal，另外一个是4个(1→6)Gal；推断侧链的构型为：(1→6)Glc和(1→6)Gal为α-构型，(1→3)Gal为β-构型；由部分酸水解和甲基化分析结果推断侧链末端残基应该是1→Gal与1→Ara，二者大概比例为1:2。
6. GPP和GPPⅡ-a能明显提高小鼠糖储备、降低血乳酸与血尿素氮的含量，说明其具有抗疲劳的作用。GPP能明显提高机体部分组织的自由基清除能力，降低组织脂质过氧化的损伤，具有保护机体由于疲劳运动导致机体氧化损伤的作用。GPP和GPPⅡ-a在提高小鼠运动能力、抗疲劳和抗氧化等方面的作用上，具有一致性，说明GPPⅡ-a可能是GPP发挥作用的主要活性成分之一。
7. 免疫实验的测定结果证实：GPPⅡ-a对疲劳运动小鼠脾脏萎缩具有明显保护作用，GPP和GPPⅡ-a具有提高疲劳运动小鼠的体液免疫的功能， GPPⅡ-a对于刀豆蛋白诱导小鼠淋巴细胞转化能力有提高作用；GPP及GPPⅡ-a使疲劳小鼠特异性免疫能力有所提高，表明GPP和GPPⅡ-a具有提高机体免疫能力。
本实验研究结果将为GPP或GPPⅡ-a作为运动保健食品的开发利用提供理论基础和应用依据。