题目：黄脸油葫芦和云斑金蟋线粒体基因组全序列的测定与分析

   动物线粒体基因组具有多态性显著、进化速率快、母系遗传和几乎不发生重组等特点，是研究基因结构、功能、转录及表达的良好模型。目前，NCBI中已收录的后生动物全线粒体基因组序列共1212种。其中，脊椎动物870种，六足类动物（Hexapoda）81种，直翅目中公布的数据有非洲飞蝗（Locusta migratoria）、东方蝼蛄（Gryllotalpa orientalis）、中华稻蝗（Oxya chinensis）、摩门螽斯（Anabrus simplex）和疑钩额螽（Ruspolia dubia）。
为了进一步研究直翅目昆虫线粒体基因组的结构与进化特征，同时也为丰富直翅目昆虫线粒体基因组全序列的数据，以便为研究直翅目乃至多新翅类的系统发育关系提供更多的生物分子数据。本研究选取直翅目蟋蟀总科的黄脸油葫芦（Teleogryllus emma）和云斑金蟋（Xenorryllus marmoratus）作为研究对象，采用基于长-PCR（Long Polymerase Chain Reaction,L-PCR）扩增及保守引物步移（Conserved Primer Walking）策略，PCR直接测序与克隆测序相结合的方法，完成了对上述两种蟋蟀的线粒体基因组全序列的测定。参照非洲飞蝗（Locusta migratoria）和东方蝼蛄（Gryllotalpa orientalis）线粒体基因组注释信息，对拼接之后的两条线粒体基因组全序列完成了注释，并结合相关物种全序列的信息，进行了综合分析。联合直翅目已公布的，以及本实验室尚未公布的线粒体基因组全序列数据，对由N链编码的ND还原酶亚单位基因（ND5、ND4、ND4L、ND1）在构建系统发育树时的适用性进行了检验，同时也对直翅目中各类群的系统发育关系进行了初步讨论。主要结果如下：
    1、黄脸油葫芦和云斑金蟋的线粒体基因组全序列长度分别为15660bp和15583bp，均包括13 个蛋白质编码基因，22 个tRNA 基因，2 个rRNA 基因和位于SrRNA 与tRNAIle之间的A+T 富集区，两种蟋蟀线粒体基因组的碱基组成具有明显的偏向性，A+T 含量分别为73.1%和71.8%；
2、云斑金蟋的线粒体基因组存在两段较长的基因间隔序列，其一位于tRNAGln 和tRNAMet之间（IR-1），长度94bp；其二位于tRNASer(UCN) 和ND1 之间（IR -2），长度99bp。两段间隔区的A+T含量分别为77.7% 和 71.7%。在这两个基因间隔区内，各发现了一个类tRNA（tRNA-Like）基因：IR-1 中为类tRNAVal；IR-2中的为类tRNALeu（CUN），它们都能形成tRNA所共有的三叶草结构，并且具有和正常tRNA 相同的反密码子，由于这是一个十分罕见的现象，我们对其所具有的功能不能确定，但倾向于将其认定为假基因；
3、两种蟋蟀线粒体基因组中，出现了一种在直翅目乃至昆虫纲中——新的基因排列方式，即tRNAGlu 、tRNASer(AGN) 和tRNAAsn 由N链编码。不是通常的ARNSEF 结构，而形成了ARESNF 结构；同时，tRNALys 与tRNAAsp 之间的结构，也与非洲飞蝗DK 结构相反，而与直翅目螽亚目的KD 结构一致；
4、黄脸油葫芦和云斑金蟋的线粒体基因组中的COⅠ 基因，不是由标准的ATN，而是由TTA作为起始密码子。而黄脸油葫芦线粒体基因组中，有10种蛋白质编码基因的终止密码子为完整的TAA 或TAG，而COII、ND5 和DN4 则以不完整的 T 作为终止密码子。云斑金蟋中则是除COⅡ 和ND5 以不完整的 T 作为终止密码子之外，其余的11种蛋白质都以TAA 或TAG 作为终止密码子；
5、22 种tRNA 除tRNA-Ser(AGN) 缺失D-臂外，都可以形成典型的三叶草结构，携带的反密码子与多数的六足类动物一致，多为GNN 或UNN 。tRNA 的4 个臂上存在不同程度的碱基错配，错配类型多为G-U 配对；
6、通过统计密码子使用的频率及与反密码子配对的情况，加之对直翅目两个亚目的7 个物种线粒体基因组内tRNA 基因A+T 含量的统计，我们试着对密码子的进化进行了初步讨论；
7、通过对A+T 富集区的研究，发现除早期分化的类群（如弹尾目）外，普遍存在于六足总纲A+T 富集区的二级结构是一个以 TA 起始，茎上具有6 个碱基对的茎-环结构。同时，经过Z-曲线的计算，推测了黄脸油葫芦和云斑金蟋线粒体基因组N 链的复制起点ON，其分别位于两个线粒体基因组的区间（15100-15119）和区间（15030-15049）；
8、联合直翅目28 个线粒体基因组中由N链编码的ND 还原酶亚单位基因（ND5、ND4、ND4L、ND1），以最大似然法（Maximum Likelihood，ML）为例，对其在构建系统发育树时的适用性进行了检验，同时也对直翅目中各类群的系统发育关系进行了初步讨论。系统树中显示，蟋蟀总科作为直翅目的基部类群，是具有单系性的，这与根据tRNA基因的排列结构得出的结论是相一致的。