题目：基于适体电化学发光法检测凝血酶的研究

蛋白质和核酸是构成生命体最为重要的两类生物大分子。蛋白质与核酸的相互作用是分子生物学研究的中心问题之一，它是许多生命活动的重要组成部分。随着人类基因组计划的完成，大量基因被发现和定位，基因的功能问题将成为今后研究的热点。大多数基因的最终产物是相应的蛋白质，因此要认识基因的功能，必然要研究基因所表达的蛋白质。核酸适体以及SELEX技术给蛋白质/核酸相互作用研究提供了一种新颖的研究方法。
电化学发光是在电极上施加一定的电压使电极反应产物之间或电极反应产物与溶液中某组分之间进行化学反应而产生的一种光辐射。根据电化学发光的强度进行的分析方法称为电化学发光分析法。该方法具有化学发光法的灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，也具有电化学法容易控制等优点。传统的检测蛋白的方法是免疫法，我们研究小组在这方面已有许多报道，但是仍然存在许多缺点。抗体只可以与抗原结合，酶只与其底物结合，而且稳定性差，酶活性容易丧失等一系列缺点。而适体不仅可以与酶、生长因子、抗体、细胞粘附分子等较大的蛋白质分子结合，而且也可以与金属离子、氨基酸、核苷、肽、药物等小分子物质结合，甚至可以与完整的病毒颗粒、细菌和细胞等结合。相对于酶和抗体/抗原，适体不仅具有良好的稳定性，而且可反复变性、复性，进行重复利用。本论文提出均相电化学发光适体分析方法的设计思想。利用适体良好的稳定性和高的特异性，以钌联吡啶为电化学发光物质，碳纳米管为信号物质载体，建立简单、快速、灵敏的新型均相电化学发光适体分析方法，研究适体与蛋白的相互作用。这项研究为建立简单、快速、灵敏的蛋白质检测技术提供可供选择的分析方法，在生物分析和临床检测中具有一定的应用前景。
本论文的目的是探索研究以凝血酶适体为分子识别物质，以钌联吡啶衍生物为电化学发光信号物质，构建高选择性简单的基于适体电化学发光法检测凝血酶的方法。本论文研究工作是在国家自然科学基金“电化学发光适体生物传感器”（No. 20775046）和“新型功能纳米材料组装电化学发光生物亲合传感器的研究”（No. 20375025）项目的资助下完成的。
本论文由前言和研究报告两部分组成。第一部分为前言，介绍了SELEX技术与核酸适体的概念与特点，以及在检测蛋白与小分子、药物等方面的应用。概述了核酸适体的应用进展，总结了电化学发光分析体系和分析方法特点，最后阐述了本论文的研究目的和内容。第二部分为研究报告，由两部分组成。
研究报告的第一部分为均相电化学发光适体检测凝血酶的研究。提出用钌联吡啶衍生物标记凝血酶适体，制得探针Ru(bpy)2(dcbpy)NHS-aptamer，然后在含有三丙胺（TPA）的杂交缓冲溶液中施加电压，记录电化学发光信号，通过电化学发光信号的变化对目标凝血酶进行检测。当不存在凝血酶时，发光物质钌联吡啶游离在电极周围，产生强的电化学发光信号；存在凝血酶时，适体形成G-四面体结构，与凝血酶结合，造成大的空间位阻以及分子量增大的复合物，发光物质远离电极，电化学发光强度降低。实验结果表明，利用钌联吡啶衍生物标记的适体探针构建的电化学发光检测凝血酶的方法，简单，快速，灵敏，而且不需要固定化；电化学发光积分强度与目标凝血酶浓度的对数在1.0×10-10 ~ 1.0×10-7 mol/L范围内成线性关系，检出限为2.5×10-11 mol/L，对5.0×10-9 mol/L 浓度的凝血酶进行11次测定，相对标准偏差为2.7%。
研究报告的第二部分是将适体I固定于磁性纳米微粒上，利用适体与凝血酶的强的结合作用来捕捉凝血酶分子，通过磁性分离技术除去未结合蛋白的干扰。另一条碳纳米管多负载电化学发光物质标记的适体探针结合凝血酶的另一位点。在一定条件下，可以构成以磁性纳米微粒为核心，适体I、适体II、凝血酶特异性结合物包夹的夹心式凝血酶电化学发光分析新方法。本研究部分设计的夹心式结构检测凝血酶的方法，利用磁性纳米微粒的磁性分离和富集样品作用，在提高测定选择性，专一性的同时，降低了发光背景，提高了测定的灵敏度。电化学发光强度与目标凝血酶浓度的对数在1.0×10-11 ~ 5.0×10-9 mol/L范围内成线性关系，检出限为1.3×10-12 mol/L，对1.0×10-10 mol/L 的凝血酶进行11次测定，相对标准偏差为5.0 %。并对适体Ⅱ与凝血酶的配位比进行研究，结果表明，配位比为1:1。